[发明专利]一种甘露聚糖酶突变体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开一种甘露聚糖酶突变体及其制备方法和应用。所述甘露聚糖酶突变体为将甘露聚糖酶的氨基酸序列进行突变后得到的蛋白质，所述突变为在甘露聚糖酶的C端添加6个精氨酸、6个赖氨酸或6个天冬氨酸。本发明构建获得高效分泌表达所述突变体的毕赤酵母工程菌，与表达野生型甘露聚糖酶的重组菌相比，表达甘露聚糖酶突变体重组菌的胞内酶活均有下降，而上清液的酶活均有提高，其中X33/ManA‑R6上清液的酶活力提高幅度最大，达549U/mL，提高了1.52倍。本发明的突变体可减少该甘露聚糖酶分泌表达时在胞内的滞留，提高分泌效率和分泌量。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种甘露聚糖酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

甘露聚糖在很多植物如大豆、玉米、角豆、魔芋等中含量较为丰富，然而植物细胞壁中的甘露聚糖在水环境中极易吸水膨胀，且黏度大大增加，导致其水解困难，因此会对上述植物资源的开发和利用造成不利的影响。β-甘露聚糖酶(β-mannanase)可水解甘露寡糖和甘露多糖(包括直链甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖等)主链中的β-1,4-D-甘露糖苷键，是甘露聚糖降解过程中的关键酶，将其添加至富含甘露聚糖的植物资源时可有效降解甘露聚糖，从而促进富含甘露聚糖植物资源的开发和利用，例如将β-甘露聚糖酶添加至动物的饲料中，可破坏植物细胞壁中的甘露聚糖，有助于释放细胞内的营养物质，降低饲料黏度，从而增加饲料的利用率和提高动物生长速度。目前β-甘露聚糖酶已广泛应用于饲料、食品、纺织、洗涤、造纸、制药等多个行业。

β-甘露聚糖酶广泛存在于植物、动物和微生物中，产甘露聚糖酶的原始菌株通常产量低且酶学性质不突出，基因工程技术的快速发展可以有效弥补上述缺陷，实现高效表达。目前已有多种不同来源的β-甘露聚糖酶在多个表达宿主中成功进行异源表达，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、毕赤酵母等。然而随着β-甘露聚糖酶的应用越来越广泛，β-甘露聚糖酶的产量有待进一步提高，因此提高β-甘露聚糖酶的表达量满足工业化生产需求，降低工业化生产成本具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种甘露聚糖酶突变体，以提高甘露聚糖酶的分泌效率，并构建得到高效分泌表达该突变体的毕赤酵母工程菌，为该突变体的广泛应用奠定基础。

为了实现上述目的，本发明提供一种甘露聚糖酶突变体，其为将甘露聚糖酶的氨基酸序列进行突变后得到的蛋白质，所述突变为在甘露聚糖酶的C端添加6个精氨酸(R6)、6个赖氨酸(K6)或6个天冬氨酸(D6)。

进一步地，其中所述甘露聚糖酶来自于嗜热好氧细菌，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示；编码所述甘露聚糖酶的基因的核苷酸序列如GeneBank Accession No.KJ806637所示。

进一步地，其中所述嗜热好氧细菌为嗜热纤维杆菌Caldibacilluscellulovorans。

进一步地，其中当所述突变为在甘露聚糖酶的C端添加6个精氨酸(R6)时，所述甘露聚糖酶突变体为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

进一步地，其中当所述突变为在甘露聚糖酶的C端添加6个赖氨酸(K6)时，所述甘露聚糖酶突变体为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

进一步地，其中当所述突变为在甘露聚糖酶的C端添加6个天冬氨酸(D6)时，所述甘露聚糖酶突变体为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

为了实现上述目的，本发明还提供一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码上述任意一种甘露聚糖酶突变体。

进一步地，其中所述核苷酸序列为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的序列。

为了实现上述目的，本发明还提供一种重组质粒，所述重组质粒含有上述的核苷酸序列。