[发明专利]新型冠状病毒实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针

说明书

本发明公开了一种新型冠状病毒实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，属于生物医学检测技术领域。本发明提供的试剂盒包括核酸提取液、检测液a、检测液b和SAT酶液，通过分步添加各组分进行分步反应可以实现对新型冠状病毒快速、准确检测，并且特异性好，灵敏度高，扩增产物RNA易降解不会引起样本交叉污染和环境污染，并且具有对仪器设备要求低和成本低的优点，大大降低了对新型冠状病毒检测的成本。

技术领域

本发明属于病毒的生物医学检测技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，尤其涉及一种将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的新型冠状病毒(2019-nCoV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针，还涉及检测新型冠状病毒的方法。

背景技术

新型冠状病毒“2019-nCoV”也称为SARS-CoV-2，与SARS病毒属于同一家族，感染该病毒后，多数患者为中轻症，预后良好，少数患者病情危重，甚至死亡。

目前临床上多采用RT-PCR方法和测序的方法对SARS-CoV-2进行检测确认，测序的方法较为复杂，不适合筛查，也不适合应急检测。RT-PCR的方法在目前临床检测中较为普遍，例如文献CN111394511A公开的RT-PCR的方法同时利用新型冠状病毒SARS-CoV-2的S基因片段、ORF1ab基因片段和N基因片段设计三组特异性引物，可以实现对新型冠状病毒的特异性检测，但其需要提前用RNA提取试剂盒进行RNA提取后检测，操作繁琐，耗时耗力，且操作过程中感染病毒的风险增加；该文献公开的反应体系同时采用三组特异性引物，对新型冠状病毒可检测至1000copies/mL，检测灵敏度欠佳，不能满足更高灵敏度检测的需要，特别是针对非临床样本，如来自河水、海水、污水、气溶胶的环境样本、物体表面附着物样本、和饮用水、食品等样本中的新型冠状病毒也需要进行检测；另外，RT-PCR方法的扩增产物为DNA，由于DNA不易降解，也增加了由检测引起的样本交叉污染或环境污染的风险，同时使用RT-PCR方法也对反应设备有较高要求，使用的设备价格较高，会大大增加检测成本。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种新型冠状病毒实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，其包括：

(1)核酸提取液：其包含含有特异性捕获探针A的固相支持物和第一引物，其中所述捕获探针A用于捕获检测序列，所述第一引物用于与靶标序列特异性结合；

(2)检测液a：其包含第二引物，所述第二引物与所述第一引物配合，用于扩增靶标序列；

(3)检测液b：其包含第一引物和靶标检测探针，其中所述靶标检测探针与所述靶标的扩增产物RNA拷贝特异性结合；

(4)SAT酶液：其包含至少一种RNA聚合酶和M-MLV反转录酶；

所述检测序列选自新型冠状病毒ORF1ab基因(简称O基因)中一段高度保守且与其他类型冠状病毒有较大差异的序列(优选SEQ ID NO:1)，和/或新型冠状病毒N基因中一段高度保守且与其他类型冠状病毒有较大差异的序列(优选SEQ ID NO:9)。

上述检测序列选自O基因，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述靶标检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示；优选地，所述特异性捕获探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

上述检测序列选自N基因，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述靶标检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:13所示；优选地，所述特异性捕获探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。