[发明专利]一种生产A82846B的基因工程菌及其制备方法

说明书

本发明公开了一种生产A82846B的基因工程菌，所述高产A82846B的基因工程菌株为荒漠拟孢囊菌SIPI‑3927‑D20(Kibdelosporangium aridum)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.19794；即在出发菌株SIPI‑3927的基因组中首先同源重组了人工构建的attB位点，然后同时整合了内源卤化酶基因orf10和内源性糖基转移酶基因orf11的工程菌。本发明基因工程菌的发酵产量和组分占比大幅提高，A82846B产量2760mg/L，A82846B组分占比达89.3％。本发明构建的荒漠拟孢囊菌基因工程菌可直接用于奥利万星中间体A82846B的工业化生产，可提高产量降低成本。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种生产A82846B的基因工程菌及其构 建/制备方法与应用。

背景技术

随着抗菌药物应用的增多，细菌的耐药性问题日益严重，耐甲氧西林金黄色 葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)在皮肤感染中的比例逐 年上升。临床通常使用糖肽类抗生素万古霉素和替考拉宁等治疗由MRSA引起的 严重感染。然而，耐万古霉素菌株的迅速出现，使得寻找新型抗MRSA抗菌药物 迫在眉睫。2014年8月6日，The Medicines公司开发的新型糖肽类抗菌药物奥利 万星获美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市，商品名为Orbactiv。该药用于治 疗由敏感革兰阳性菌(包括MRSA)引起的急性细菌性皮肤和皮肤结构感染的首个 和唯一一种单剂量治疗方案的抗生素。奥利万星(Oritavancin)是在第一代糖肽抗生 素的基础上开发的第二代糖肽抗生素，其作用机制是通过阻断肽聚糖生物合成时 转糖苷作用抑制细菌细胞壁的形成。故该类化合物对细菌细胞具有高度的特异性， 能迅速杀灭细菌而对人体正常细胞影响较小，因而疗效好，安全性高。

A82846B是奥利万星的合成前体，分子式是C₈₆H₉₇Cl₂N₁₀O₂₆，它的结构与多 数糖肽类抗生素的结构类似，是万古霉素的结构相类似。目前，大规模微生物发 酵法是生产A82846B的主要方式，发酵液还会有A82846A和A82846C产生。 A82846A和A82846C都是A82846B的结构类似物，三者的结构式如下式1所示， 三者的区别在于糖肽骨架的2位和6位氨基酸残基的取代基上的氯原子，A82846B 在2和6位取代基上各有一个氯原子，A82846A只在2位取代基有一个氯原子， A82846C没有氯原子(表1)。由于发酵液中A82846A和A82846C产生，给A82846B 的生产和后续的分离纯化增加了成本。由式可知，三种物质结构非常接近，分离 纯化工作比较困难。目前，关于奥利万星关键中间体A82846B提取分离的文献报道较少。欧洲专利EP0280570A2及美国专利US4845194公开了三种物质的分离方 法，其中A82846B的分离方法为：将发酵液通过阳离子(NH⁴⁺)交换树脂进行初 步富集，然后通过制备性高效液相色谱柱分离，最后经过HP20ss树脂精制。专利 中主要进行了此3步纯化，后面的两个步骤的收率仅为29％，总收率更低。

因此，通过构建新的生产A82846B的发酵菌株，从而减少发酵过程中结构类 似物的含量，从而降低生产成本，简化操作步骤，降低环境污染，提高收率，满 足工业化生产的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中上述A82846B发酵过程中，副产 物A82846A和A82846C产生，减少生产A82846B及其分离纯化的时间和经济成 本；提供一种生产A82846B的高产低杂基因工程菌及其构建方法和应用，可以利 用基因工程技术提高生产A82846B的效率，降低成本。