[发明专利]一种高通量、快速的半定量免疫检测方法及检测试剂

权利要求书

1.一种高通量、快速的半定量免疫检测方法，其特征在于，所述半定量免疫检测方法，以微球表面包被待测物的一个多克隆抗体或至少两个单克隆抗体后进行待测物的免疫检测，通过对原粒径的微球数量的减少量或减少比例进行样本中待测物浓度的估算。

2.根据权利要求1所述半定量免疫检测方法，其特征在于，所述待测物浓度的估算方法为：

(1)制作粒径减少比例的标准浓度曲线：制备不同浓度梯度的待测物标准溶液，分别与表面包被抗体的微球进行免疫反应，测定对应粒径范围内微球的减少比例，制备待测物浓度-粒径减少比例的标准曲线；

(2)将样本进行免疫检测后的原粒径的微球数量的减少比例代入步骤(1)中制备的标准曲线中，获得其对应的待测物的浓度梯度范围，即为所估算的样本中待测物浓度。

3.根据权利要求2所述半定量免疫检测方法，其特征在于，所述半定量免疫检测方法，分别制备不同粒径规格的微球，不同粒径规格的微球表面包被对应的不同待测物的一个多克隆抗体或至少两个单克隆抗体后同时进行多种待测物的免疫检测，通过对不同粒径的微球数量的减少量或减少比例进行样本中对应待测物浓度的估算。

4.根据权利要求1至3任一所述半定量免疫检测方法，其特征在于，所述微球采用高分子微球。

5.根据权利要求4所述半定量免疫检测方法，其特征在于，所述微球采用聚苯乙烯微球、聚苯乙烯/聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚苯乙烯/聚丙烯酸微球。

6.根据权利要求1至3任一所述半定量免疫检测方法，其特征在于，所述微球表面包被抗体的方法采用羧基共价交联、物理吸附。

7.根据权利要求5所述半定量免疫检测方法，其特征在于，所述微球采用聚苯乙烯微球，并通过以下方法进行表面抗体包被：首先，制备羧基修饰的聚苯乙烯微球，然后经微球活化后，再进行抗体交联，最后进行封闭。

8.一种高通量、快速的半定量免疫检测试剂，其特征在于，所述半定量免疫检测试剂通过以下方法制备：

(1)羧基修饰聚苯乙烯微球：将粒径大小相对一致的聚苯乙烯微球混合至醇水溶液中，混合均匀后，在氮气保护下加入偶氮二异丁氰、苯乙烯、二乙烯基苯的混合溶液，通氮气30分钟，升温至70℃，搅拌冷凝回流24小时，将产物高速离心后，弃去上清液，醇水溶液洗涤，50℃恒温干燥至恒重；

(2)微球活化：将步骤(1)中修饰后的微球溶于水中，制备浓度为0.1％(W/V)的溶液，加入EDAC和NHS水溶液，混合后室温放置4小时，高速离心弃去上清液，取沉淀的微球用MES缓冲液重悬；

(3)交联抗体：取待测物对应抗体，加入步骤(2)制备得到的微球溶液中，30℃水浴搅拌4小时，高速离心去上清液，将沉淀的交联微球用MES缓冲液重悬；

(4)封闭：向步骤(3)中的交联微球溶液中加入BSA溶液，室温下搅拌1小时后，离心去上清液，取沉淀物用MES重悬，即得所述半定量免疫检测试剂。

9.根据权利要求8所述半定量免疫检测试剂，其特征在于，所述半定量免疫检测试剂可同时进行多种待测物免疫检测时，步骤(1)中分别选取多种与待测物一一对应的不同粒径微球，不同粒径的微球依次通过后续步骤(1)、(2)、(3)、(4)分别进行对应待测物的不同抗体的交联封闭，最后将所有交联抗体后的微球溶液混合后，即得所述半定量免疫检测试剂。

10.根据权利要求9所述半定量免疫检测试剂，其特征在于，所述半定量免疫检测试剂可同时进行三种待测物免疫检测时，步骤(1)中分别选取对应的三种不同粒径微球，三种粒径分别控制在1μm、2μm、3μm，不同粒径的微球依次通过后续步骤(1)、(2)、(3)、(4)分别进行对应待测物的不同抗体的交联封闭，最后将所有交联抗体后的微球溶液混合后，即得所述半定量免疫检测试剂。