[发明专利]检测重组慢病毒滴度的核酸组合物、试剂盒和方法

说明书

本发明涉及一种检测重组慢病毒滴度的核酸组合物、试剂盒和方法，该核酸组合物包括引物对和探针，引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示，探针上连接有荧光基团。该核酸组合物用于检测含有CD247基因的重组慢病毒滴度时的特异性好，准确性高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测重组慢病毒滴度的核酸组合物、试剂盒和方法。

背景技术

肿瘤和自身免疫性疾病的发生与感染、基因突变和环境刺激等多种因素有关。研究发现，CD247基因在慢性炎症、自身免疫性疾病和肿瘤发展过程中发挥重要作用。CD247(又称CD3Z或TCRZ)基因位于人染色体1q24.2，属于CD3Z/FCERIG家族。CD247基因编码产物为CD3分子的两条ζ链，与T细胞抗原受体αβ(也称TCRαβ)或γδ(也称TCRγδ)和CD3γ、ε、δ链以非共价键共同组成TCR/CD3复合物。TCR主要功能是识别与结合MHC抗原肽复合物，CD3则进一步将TCR识别的信号转入T淋巴细胞，诱导T淋巴细胞活化，TCR/CD3膜表达水平决定了T淋巴细胞活化的启动。CD3分子亚单位的胞内段含有一个共同的序列，即免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)。该序列与抗原识别后淋巴细胞的活化及信号转导关系密切，其中CD3γ、ε、δ链各含1个ITAM，而ζ链含3个ITAM。CD3-ζ链是1种高度保守的结构，由164个氨基酸组成，其主要功能是参与TCR/CD3复合物的装配、表达以及信号转导。

目前，利用CD247阳性的CAR-T治疗肿瘤的动物实验正在进行中，CD16+CD247+T细胞和Mogamulizumab(CCR4抗体)耦合的CAR-T治疗急性淋巴细胞性白血病的基础研究发现其可增加机体的免疫活性，为肿瘤的治疗提供新策略。

目前主要通过将CD247基因整合到慢病毒载体中形成重组慢病毒，然后将该重组慢病毒并转染到宿主细胞实现CD247基因的体外表达。在重组慢病毒制备的过程中，重组慢病毒的滴度是衡量重组慢病毒的制备是否成功以及重组慢病毒的质量的重要指标。目前常用的测定含有CD247基因的重组慢病毒滴度的方法有酶联免疫(ELISA)法、流式细胞术法(FACS)和定量PCR法。

ELISA法是通过检测含有CD247基因的重组慢病毒中P24蛋白的含量，通过比活的关系推算重组慢病毒滴度。由于该方法仅仅测定了含有CD247基因的重组慢病毒的颗粒数，并没有测定含有CD247基因的重组慢病毒对靶细胞的实际感染能力，因此ELISA法测定的是含有CD247基因的重组慢病毒的物理滴度而非实际生物滴度。此外，由于含有CD247基因的重组慢病毒的悬液中往往含有一定的游离的P24蛋白，因此ELISA法通常过高地估计病毒滴度。

FACS法虽然较准确的测定含有CD247基因的重组慢病毒滴度，但该方法不能测定无标记基因的含有CD247基因的重组慢病毒，需要重组慢病毒表达标记基因或者需要筛选或制备与慢病毒载体能够相连的带有荧光基团结合位点的抗体，此研发工作量大，研究困难。

定量PCR法主要通过针对慢病毒空载体上的元件设计引物而测定含有CD247基因的重组慢病毒感染的靶细胞中平均每个细胞基因组中病毒基因组的拷贝数，可在一定程度上反应含有CD247基因的重组慢病毒的滴度，也可以测定无标记基因的含有CD247基因的重组慢病毒滴度。然而，在实际应用中发现，定量PCR法的测定含有CD247基因的重组慢病毒时的特异性差，准确性较低。

发明内容

基于此，有必要提供一种检测重组慢病毒滴度的核酸组合物，该核酸组合物可应用于无标记基因的含有CD247基因的重组慢病毒滴度的检测，且特异性好。

一种检测重组慢病毒滴度的核酸组合物，包括引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示，所述探针上连接有荧光基团。