[发明专利]一种采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物、探针和方法

说明书

本发明涉及采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物、探针和方法，可有效解决人类血液中布鲁氏菌定量检测的问题，其解决的技术方案是，采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物和探针，引物和探针序列是：上游引物:5’‑GGAAGGTTCAGAAACAACCAC‑3’，下游引物：5’‑GTTGTAACCGGCCTGAACAC‑3’，探针：5’‑FAM‑TGCTGCTCCAGTTGACACCTTCTCG‑BHQ1‑3’，本发明稳定性良好、灵敏度高、特异性强，采用实时荧光定量PCR技术，可准确检测出人类血液中布鲁氏菌含量，对布病的准确诊断及防控策略的制定有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物、探针和方法。

背景技术

布鲁氏菌病（布病）由布鲁氏菌引起的人畜共患自然疫源性传染病，它危害严重，流行广。布鲁氏菌可感染人类、多种家畜和野生动物，引起发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损害，是一种重要的生物战剂和生物恐怖剂，目前诊断布病主要采用血清学和细菌学方法。血清学方法种类繁多，但总的来说还没有任何一种方法在特异性、敏感性及可操作性等方面均令人满意，细菌培养虽可直接查到病原体，但由于布鲁氏菌分离培养条件要求苛刻，阳性率很低，且分离过程中，存在操作人员面临被布鲁氏菌感染的危险及病菌从实验室扩散的风险。因此建立一种快速、准确的布鲁氏菌检测方法，对布病的诊断、治疗、预防以及最终控制布病均具有重要的意义。

近年来，伴随着分子生物学技术的飞速发展，快速特异、灵敏度高、操作简便的聚合酶链反应技术已被引入到细菌性传染病的流行病学调查及诊断中，并初步显示了其应用前景。国内外学者在利用PCR技术检测布鲁氏菌病方面做了较多的研究工作，其中BaileyGG等按牛种布鲁氏菌31KDa外膜蛋白基因的核苷酸序列设计了5个引物B1～B5，将引物按不同组合做扩增试验，结果显示B4 和B5配对最好。Ohtsuki R等根据流产布鲁氏菌 BCSP31株的基因序列设计两组用于6个种布鲁氏菌鉴别的环介导等温扩增(LAMP)的特异性引物，通过对6个种22株布鲁氏菌和18个种28株非布鲁氏菌的检测表明，对布鲁氏菌的检测具有特异性(35 min，63℃)和敏感性(10 fg基因组DNA)。李坚等根据布鲁氏菌编码312 kDa布鲁氏菌蛋白的基因(BSCP31)和IS711插入序列及相邻单染色体DNA种的不同，设计引物，建立AMOS-PCR方法，用于诊断布鲁氏菌病，并鉴定种，实时荧光定量PCR技术解决了传统PCR 技术的不足，已经成为细菌、病毒等微生物快速定量检测的首选技术。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物、探针和方法，可有效解决人类血液中布鲁氏菌定量检测的问题。

本发明解决的技术方案是，采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物和探针，引物和探针序列是：

上游引物:5’-GGAAGGTTCAGAAACAACCAC-3’

下游引物：5’-GTTGTAACCGGCCTGAACAC-3’

探针：5’-FAM-TGCTGCTCCAGTTGACACCTTCTCG-BHQ1-3’。

一种采用实时荧光定量PCR技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物和探针在制备试剂盒中的应用。

一种采用实时荧光定量PCR定量检测人类血液中布鲁氏菌试剂盒包括置于盒体内的用于定量检测人类血液中布鲁氏菌的特异性扩增引物和探针，从血浆中提取基因组DNA，并进行荧光定量PCR的试剂。