[发明专利]一种基于细菌模型评价活性化合物抗氧化应激效益的方法

权利要求书

1.一种基于细菌模型评价活性化合物抗氧化应激效益的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)大肠杆菌的培养：将大肠杆菌菌种加入无菌液体培养基中培养，待大肠杆菌生长进入对数期，离心后收集大肠杆菌，等渗溶液清洗后重悬于等渗溶液中，测定大肠杆菌死亡率小于20％，得到大肠杆菌悬浮液；

(2)分组、氧化应激诱导以及测试组给药处理：将步骤(1)所述大肠杆菌悬浮液均分为空白对照组、氧化应激诱导组、氧化应激诱导并给药测试组后，分别在37℃孵育2小时，测定大肠杆菌死亡率小于70％，离心后去上清，收集下层大肠杆菌；

所述空白对照组是向大肠杆菌悬浮液中加入大肠杆菌等渗溶液；所述氧化应激诱导组是向大肠杆菌悬浮液中加入氧化应激诱导剂，所述氧化应激诱导剂为诱导剂与大肠杆菌等渗溶液的混合物；所述氧化应激诱导并给药测试组是向大肠杆菌悬浮液中加入氧化应激诱导剂和活性化合物混合溶液；

所述活性化合物为噻唑脯氨酸；所述大肠杆菌等渗溶液为无菌PBS缓冲液；所述诱导剂与大肠杆菌等渗溶液的混合物为过氧化氢溶液与无菌PBS缓冲液的混合溶液；

(3)大肠杆菌中甲酰赖氨酸的提取：将步骤(2)中收集的各组大肠杆菌重悬后制样处理，得到甲酰赖氨酸提取液样本；

(4)测试品的抗氧化应激效果判别：测量步骤(3)中提取的各组甲酰赖氨酸提取液样本中的甲酰赖氨酸的含量并比较，进行统计学分析，若测试组比氧化应激诱导组中甲酰赖氨酸含量明显降低，则测试组的活性化合物具有抗氧化应激功能。

2.根据权利要求1所述的一种基于细菌模型评价活性化合物抗氧化应激效益的方法，其特征在于：在步骤(1)和步骤(2)中，所述测定大肠杆菌死亡率的方法为细胞染色法。

3.根据权利要求1所述的一种基于细菌模型评价活性化合物抗氧化应激效益的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述空白对照组、氧化应激诱导组、氧化应激诱导并给药测试组的任意一组设置平行样品，所述平行样品数量大于两个，大肠杆菌在任意一个所述平行样品中的体积比为1％-5％。

4.根据权利要求1所述的一种基于细菌模型评价活性化合物抗氧化应激效益的方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述制样处理过程具体步骤为：

(a)将所述步骤(2)中收集到的大肠杆菌样品重悬于无菌PBS缓冲液中，在-80℃和常温之间反复冻融3次，然后在4℃超声，使大肠杆菌细胞完全破碎，得到细胞破碎液；

(b)向步骤(a)中的细胞破碎液中加入4倍体积的-20℃预冷提取液，所述提取液是乙腈、丙酮与水按照体积比4：4：2混合得到的混合液，然后涡旋振荡30秒，充分混匀得到的细胞破碎液的混合提取液；

(c)将步骤(b)中的混合提取液在4℃，10000-12000rpm的条件下离心10分钟，将上清液真空浓缩冷冻干燥得到粗提物；

(d)向步骤(c)中的粗提物中加入乙腈水溶液，充分溶解后加入氨水溶液和FMOC乙腈溶液，室温震荡后，在4℃10000-12000rpm离心10分钟，取上清并用水相滤膜过滤得到滤液，所述滤液用于分析甲酰赖氨酸含量。

5.根据权利要求1所述的一种基于细菌模型评价活性化合物抗氧化应激效益的方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述统计学分析为判断给药后甲酰赖氨酸的降低是否具有显著性，对测试样品的抗氧化应激效果进行判别，各个平行样品之RSD小于20％。