[发明专利]一种分离纯化人抗凝血酶Ⅲ的方法

说明书

发明提供一种分离纯化人抗凝血酶Ⅲ的方法，属于生物制品及血液制品技术领域。本发明方法中采用了UniGel‑65 Heparin凝胶层析对ATⅢ进行分离纯化。该层析填料以UniGel为基质，与肝素钠进行偶联得到，所述UniGel为表面亲水修饰过的单分散球形多孔交联聚丙烯酸酯“硬胶”层析介质，使用该肝素凝胶对ATⅢ进行分离纯化能使其柱保留时间缩短至不超过3min，实现快速上样、节约工艺时间；且分离后的本发明方法步骤为：1.取冰冻人血浆离心去除冷沉淀DEAE SephdexA50凝胶吸附，得到的DEAE SephdexA50吸附后血浆；2进行肝素亲和层析，得到的洗脱液为一步层析分离纯化后的ATⅢ产品；亲和层析步骤为：平衡、上样、冲洗、洗涤、洗脱，较传统的层析步骤增加了一步冲洗，能提高ATⅢ的收率。

技术领域

本发明涉及生物制品及血液制品技术领域，具体涉及一种分离纯化人抗凝血酶Ⅲ的方法。

背景技术

人抗凝血酶Ⅲ(AntithrombinⅢ，以下简称“ATⅢ”)是血液抗凝血系统中的主要成份的主要成分，占人体总抗凝能力的70～80％，是血液中抗凝的关键物质，作为血液中活性凝血因子最重要的阻碍因子，它控制着血液的凝固和纤维蛋白的溶解，参与保持体内抗凝血功能和纤溶系统与凝血系统的动态平衡，并起着抗凝调节作用。临床上，血液中ATⅢ的水平随各种疾病、症状而变化，弥散性血管内凝血(DIC)、肝疾患、肾病综合症等疾病患者的ATⅢ血浆水平降低。

二十世纪60-70年代即开始有人报道纯化ATⅢ的工艺，但是仅限于实验室开发，1972年Heimburger等首次分离并鉴定ATⅢ为α2单链糖蛋白，但是其回收率较低，大约在2％左右，1974年Miller等使用肝素亲和胶从血浆中纯化ATⅢ，其活性回收率为34％，纯度在90％以上，1979年，Wiker等用Cohn组分IV-1沉淀制备临床用ATⅢ浓缩物。纵观ATⅢ的分离纯化历史，除了最初采用氢氧化铝、磷酸钙吸附、离子交换层析等制备方法外，自1970年以来，ATⅢ的制备方法中都至少用了一次肝素亲和层析，缩短了流程，提高了收率和纯度。二十世纪90年代以后，国外血液制品企业开发了以层析技术为基础的新的分离纯化工艺，直接用去冷沉淀的血浆为原料进行亲和层析制备ATⅢ的技术得到应用和推广，如CSL公司、LFB公司等都采用此工艺进行制备ATⅢ制品。

国内最早报道制备ATⅢ浓缩物的专家为中国医学科学院输血所的刘文芳教授，也是采用肝素亲和层系的方法，直接用血浆进行制备，采用巴氏病毒灭活法进行病毒灭活，最终收率大约在13～25％。比活可达7.5IU/mg左右。

由此可见肝素亲和层析对分离纯化ATⅢ至关重要，目前常见市售的肝素亲和凝胶有GE公司生产的Heparin SepHarose FF和Capto Heparin；Tosoh公司生产的ToyopearlAF-Heparin和HC-650M-Heparin；Pall公司生产的Heparin HyperD等，采用的基质大多为葡聚糖、琼脂糖、硅基等，此类基质耐压性能差，生产中需要降低柱高、减小流速以防止压力过高造成柱床塌陷，限制了批处理量及生产效率、传质速度慢。因此现有市售的肝素亲和凝胶需要在柱保留时间长、流速慢的条件下，吸附载量才会比较高，而在高流速下动态载量下降的非常快。

中国专利CN104672328B公布了一种人抗凝血酶Ⅲ的生产方法，步骤为：将新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀获得血浆上清，上清液使用DEAE Sephadex A50凝胶吸附处理，血浆上清沉淀除杂质蛋白后经深层过滤，滤液经Capto Heparin亲和层析，S/D病毒灭活及Capto Q离子交换层析去除S/D试剂，纳米膜过滤去除病毒、配制、冻干、干热。其中该专利采用CaptoHeparin层析洗脱后，ATⅢ比活为8.45IU/mg，相对于上一阶段的收率仅为60％，但未对其柱保留时间进行研究。山东大学张翠萍发表的硕士论文《人抗凝血酶Ⅲ分离纯化工艺研究》中通过对比现有市售的几种肝素亲和凝胶后选择Capto Heparin作为分离纯化ATⅢ的的亲和层析凝胶，关注点均在分离效果上而未对层析过程中的柱保留时间进行优化，所选用亲和层析凝胶均为现市场上常销售的几种材料。