[发明专利]一种检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒

权利要求书

1.一种检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒，其特征在于，包括吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体、生物素标记8-A8-B8捕获抗体；

所述吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体是将单克隆抗体76-G3-G5通过吖啶酯标记后制得，所述单克隆抗体76-G3-G5是由杂交瘤细胞株76-G3-G5分泌获得；

所述生物素标记8-A8-B8捕获抗体是先将单克隆抗体8-A8-B8利用生物素标记，然后再与包埋有亲和素的磁珠结合后制得，所述单克隆抗体8-A8-B8是由杂交瘤细胞株8-A8-B8分泌获得；

所述杂交瘤细胞株76-G3-G5保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCC NO：C2020139；所述杂交瘤细胞株8-A8-B8保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCC NO：C2020140。

2.根据权利要求1所述的化学发光试剂盒，其特征在于，所述杂交瘤细胞株76-G3-G5和杂交瘤细胞株8-A8-B8的筛选配对获得的具体方法如下：

S1、人工合成人可溶性CD14基因，将人可溶性CD14基因重组到表达载体质粒pATX2-FC中，得到sCD14-pATX1-FC表达载体质粒；克隆位点为EcoRI/XbaI，人可溶性CD14基因的基因序列如SEQ NO.1所示；

制备mGM-CSF免疫佐剂质粒的基因序列如SEQ NO.2所示；

S2、将sCD14-pATX1-FC表达载体质粒转染到293F细胞系中培养，收集上清液进行镍柱纯化得到人可溶性CD14；

S3、将sCD14-pATX1-FC表达载体质粒和mGM-CSF免疫佐剂质粒加至乳酸林格氏缓冲液中，sCD14-pATX1-FC表达载体质粒和mGM-CSF免疫佐剂质粒的浓度分别为200μg/mL、2.5μg/mL；对小鼠进行尾静脉注射，注射剂量2mL/次，每周免疫1次，共免疫3次；

第3次免疫结束后，用人可溶性CD14免疫若干小鼠，每只小鼠的免疫剂量为50μg，取血清效价检测合格的小鼠进行细胞融合，再进行间接Elisa筛选，将筛选得到的阳性克隆用有限稀释法进行亚克隆，得到若干株杂交瘤细胞株；

S4、将步骤S3所得的若干杂交瘤细胞株分泌的抗体分别进行吖啶酯标记和生物素标记，得到吖啶酯标记的检测抗体和生物素标记的捕获抗体，并制备人可溶性CD14的标准品、质控品；

S5、选择步骤S4所得吖啶酯标记的检测抗体、生物素标记的捕获抗体进行配对，再与含有人可溶性CD14的溶液同时加至孵育槽中孵育，再通过清洗、磁性分离，得到若干组双抗体夹心复合物；加入化学发光底物液测定各组的发光强度，筛选出最佳配对的吖啶酯标记的检测抗体和生物素标记的检测抗体，即获得对应的最佳配对的杂交瘤细胞株。

3.根据权利要求2所述的化学发光试剂盒，其特征在于，步骤S4中，杂交瘤细胞株分泌的抗体进行吖啶酯标记的具体方法为：

S411、取吖啶酯用N,N-二甲基甲酰胺溶解，浓度3mg/ml，得吖啶酯溶液；

S412、将杂交瘤细胞株分泌的抗体溶解于磷酸盐缓冲液中，并用碳酸盐缓冲液调至pH值为9.0，终浓度2-5mg/ml，得抗体溶液Ⅰ；

S413、按每mg抗体加14ul吖啶酯溶液的比例，将吖啶酯溶液和抗体溶液Ⅰ混匀后于25℃避光搅拌2小时；

S414、按1:1的重量比加入赖氨酸终止反应，25℃避光搅拌0.5小时，收集反应物使用磷酸盐缓冲液透析过夜，中途更换磷酸盐缓冲液3-4次，得吖啶酯标记的检测抗体；

杂交瘤细胞株分泌的抗体进行生物素标记的具体方法为：

S421、生物素使用N,N-二甲基甲酰胺溶解，浓度20mg/ml，得生物素溶液；

S422、将杂交瘤细胞株分泌的抗体溶解于磷酸盐缓冲液中，并用碳酸盐缓冲液调至pH值为8.5，终浓度1-10mg/ml，得抗体溶液Ⅱ；

S423、按每mg抗体加5ul生物素溶液的比例，将生物素溶液和抗体溶液Ⅱ混匀后于室温避光搅拌2小时；

S424、收集反应物使用磷酸盐缓冲液透析过夜，中途更换磷酸盐缓冲液3-4次；

S425、步骤S424所得溶液中加入包埋有亲和素的磁珠溶液，25℃避光搅拌2小时，得生物素标记的检测抗体。