[发明专利]耐药基因sul1的RPA检测引物组、试剂盒和方法

说明书

本发明公开了耐药基因sul1的RPA检测引物组、试剂盒和方法。涉及分子生物学技术领域。包括1对引物和1个探针，并提供了检测试剂盒和非诊断治疗的检测方法和引物组的应用。本发明仅需具备温控功能的荧光检测仪器，可在39℃条件下对sul1进行快速、实时、灵敏、准确、便捷的检测。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体的说是涉及耐药基因sul1的RPA检测引物组、试剂盒和方法。

背景技术

磺胺类药物为人工合成的抗菌药，对许多革兰氏阳性菌和一些革兰氏阴性菌、诺卡氏菌属、衣原体属和某些原虫(如疟原虫和阿米巴原虫)均有抑制作用。因其在医学临床、畜牧业及农业上使用的逐年增加及不合理用药情况，给公共卫生安全和畜牧业发展构成了严重威胁。目前，由质粒介导的磺胺耐药基因的迁移极大地推进了磺胺耐药性在细菌间的传播。常见的磺胺耐药基因有3种，分别是sul1、sul2和sul3。其中sul1较为常见，在多种细菌中均被检出。

对于sul1基因的实验室诊断主要是常规PCR、Sanger测序、荧光定量PCR和LAMP等方法。这些技术有的耗时耗力，有的灵敏度低，有的需要借助于大型精密仪器。

因此，如何提供一种检测耐药基因sul1的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了耐药基因sul1的RPA检测引物组、试剂盒和方法。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度约37℃。其原理是：重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计。需要注意的是与PCR引物不同，RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基；且在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素；RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，需要自己摸索条件进行优化。

本发明验证了检测的灵敏度和特异性，并成功检测了待检株中的sul1核酸。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种耐药基因sul1的RPA检测引物组，包括1对引物和1个探针，引物和探针如下：

sul1-F1：ATGCACCGTGTTTCAATCGACAGCTTCCAACCG；SEQ ID NO1；

sul1-R1：GAAGGTGACCGGTGCGGGTGGCGATGCCATCCCG；SEQ ID NO2；

探针sul1-probe：5’-TCCTGACCCTGCGCTCTATCCCGATATTGCTCTGCAGTCCGCCTC-3’，SEQ ID NO3；

其中，离5’端碱基数28bp的胸腺嘧啶T由FAM荧光基团标记；离5’端碱基数29bp的G和30bp的C之间的碱基插入四氢呋喃残基；离5’端碱基数31bp的T由荧光淬灭基团BHQ标记。

探针sul1-probe可表示为：5’-TCCTGACCCTGCGCTCTATCCCGATAT

[FAM-dT]G[THF]C[BHQ-dT]CTGCAGTCCGCCTC-3；