[发明专利]促进间充质干细胞定向分化为胰岛细胞的增殖培养方法

说明书

本发明提供了一种促进间充质干细胞定向分化为胰岛细胞的增殖培养方法，其方法包括步骤：(1)获取间充质干细胞，并传代培养；(2)将间充质干细胞接种在培养板上，于培养基A中培养1～2天；之后于培养基B中培养，每天更换一次培养基，共培养7～8天；然后，于培养基C中培养12～15天，获得胰岛细胞。本发明可以获得成熟的胰岛样细胞，并可以使得分化的细胞内外均具有含量高的胰岛素和C‑肽。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及细胞培养技术，具体涉及一种促进间充质干细胞定向分化为胰岛细胞的增殖培养方法。

背景技术

胰岛移植是治疗糖尿病的有效疗法之一，但是胰岛来源不足却严重制约了该疗法的临床应用。利用干细胞强大的自我更新能力以及分化潜能，可解决胰岛来源不足的问题。

现有技术通常比较关注分化细胞数目的多寡，而不重视分化细胞中的胰岛素含量和C-肽含量，使得分化培养技术存在缺陷。目前，现有技术中所得的胰岛β样细胞胞外胰岛素含量仅可达到200多ng/mg的水平。因此，本领域亟需一种可以提高胰岛β样细胞保内外胰岛素含量的方法。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种促进间充质干细胞定向分化为胰岛细胞的增殖培养方法，本发明方法可以使得分化的细胞内外的胰岛素和C-肽(C-peptide)的含量显著的增加。

为了实现上述目的，本发明提供的方案如下：

一种促进间充质干细胞定向分化为胰岛细胞的增殖培养方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取间充质干细胞，并传代培养；

(2)将间充质干细胞接种在培养板上，于培养基A中培养1～2天；之后于培养基B中培养，每天更换一次培养基，共培养7～8天；然后，于培养基C中培养12～15天，获得胰岛细胞；

其中，所述培养基A为含有10％的胎牛血清的DMEM/F12培养基；

所述培养基B以DMEM/F12培养基为基础培养基，并添加20～25μmol白藜芦醇、2～3μmol全反式维甲酸、6～8μmol尼克酰胺、0.1～0.2μmol五肽胃泌素、1～10μmolL-谷氨酰胺、0.1～0.2μmol血小板源性生长因子、1～2μmolL-谷氨酰胺成纤维细胞生长因子、0.3～0.5μmol胰高血糖素样肽I；

所述培养基C以DMEM/F12培养基为基础培养基，并添加20～25μmol白藜芦醇、2～3μmol全反式维甲酸、6～8μmol尼克酰胺、1～10μmolL-谷氨酰胺、0.1～0.2μmol血小板源性生长因子、1～2μmolL-谷氨酰胺成纤维细胞生长因子、0.05～0.1μmol胰岛素样生长因子、0.01～0.02μmol激活素A。

在本发明的研究过程中，我们发现培养基B和培养基C的配置选择，对于最终结果影响较大。在培养基B中，培养基中的五肽胃泌素和胰高血糖素样肽I的添加，具有重大影响，同时，我们还发现，这两者的添加具有一定的协同作用。值得指出的是，虽然我们发现五肽胃泌素和胰高血糖素样肽I的添加具有重要作用，但两者的作用是基于其它配方组分是既定的情况下的，需要配合其它组分所发挥的综合作用。培养基C与培养基B相比，少了五肽胃泌素，多了胰岛素样生长因子和激活素A。我们发现，培养基C的优化，可以使得分化细胞的胰岛素和C-肽含量更高。

在本发明中，一个可选的方案是，所述间充质干细胞为从脐带分离而获得的。

在本发明中，一个可选的方案是，所述的分离的方法以及传代方法为：取健康足月产儿脐带，长度为5～10cm，直径为1～2cm，于高压灭菌的PBS溶液内放置，4℃保存，4h内使用；之后分离华通氏胶，剪成组织块，利用10％FBS培养基培养至细胞融合度达80％以上，胰酶消化后，再用10％FBS培养基培养至细胞融合度达90％以上之后进行传代