[发明专利]促进间充质干细胞定向分化为胰岛细胞的增殖培养方法

权利要求书

1.一种促进间充质干细胞定向分化为胰岛细胞的增殖培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)获取间充质干细胞，并传代培养；

(2)将间充质干细胞接种在培养板上，于培养基A中培养1～2天；之后于培养基B中培养，每天更换一次培养基，共培养7～8天；然后，于培养基C中培养12～15天，获得胰岛细胞；

其中，所述培养基A为含有10％的胎牛血清的DMEM/F12培养基；

所述培养基B以DMEM/F12培养基为基础培养基，并添加20～25μmol白藜芦醇、2～3μmol全反式维甲酸、6～8μmol尼克酰胺、0.1～0.2μmol五肽胃泌素、1～10μmol L-谷氨酰胺、0.1～0.2μmol血小板源性生长因子、1～2μmol L-谷氨酰胺成纤维细胞生长因子、0.3～0.5μmol胰高血糖素样肽I；

所述培养基C以DMEM/F12培养基为基础培养基，并添加20～25μmol白藜芦醇、2～3μmol全反式维甲酸、6～8μmol尼克酰胺、1～10μmol L-谷氨酰胺、0.1～0.2μmol血小板源性生长因子、1～2μmol L-谷氨酰胺成纤维细胞生长因子、0.05～0.1μmol胰岛素样生长因子、0.01～0.02μmol激活素A。

2.根据权利要求1所述的增殖培养方法，其特征在于，所述间充质干细胞为从脐带分离而获得的。

3.根据权利要求2所述的增殖培养方法，其特征在于，所述的分离的方法以及传代方法为：取健康足月产儿脐带，长度为5～10cm，直径为1～2cm，于高压灭菌的PBS溶液内放置，4℃保存，4h内使用；之后分离华通氏胶，剪成组织块，利用10％FBS培养基培养至细胞融合度达80％以上，胰酶消化后，再用10％FBS培养基培养至细胞融合度达90％以上之后进行传代。

4.根据权利要求1所述的增殖培养方法，其特征在于，所述培养基B以DMEM/F12培养基为基础培养基，并添加20μmol白藜芦醇、2.5μmol全反式维甲酸、7μmol尼克酰胺、0.18μmol五肽胃泌素、6μmol L-谷氨酰胺、0.15μmol血小板源性生长因子、1.8μmol L-谷氨酰胺成纤维细胞生长因子、0.4μmol胰高血糖素样肽I。

5.根据权利要求1所述的增殖培养方法，其特征在于，所述培养基C以DMEM/F12培养基为基础培养基，并添加22.5μmol白藜芦醇、2.2μmol全反式维甲酸、7μmol尼克酰胺、6μmolL-谷氨酰胺、0.12μmol血小板源性生长因子、1.5μmol L-谷氨酰胺成纤维细胞生长因子、0.08μmol胰岛素样生长因子、0.01μmol激活素A。