[发明专利]一种CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立方法及其应用

说明书

本发明公开了一种CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立方法及其应用，包括以下步骤：sgRNA设计；CRISPR/Cas9‑Mmk1‑sgRNA载体的构建；转化并筛选阳性克隆；原生质体的制备；原生质体转化。本发明以CRISPR/Cas9技术为切入点，以桑椹缩小型菌核病菌Scleromitrula shiraiana为研究对象，利用CRISPR/Cas9载体系统，并构建菌核形成相关基因Mmk1相应的CRISPR/Cas9编辑载体，通过PEG介导的原生质体转化实现对S.shiraiana内源基因Mmk1的高效编辑，在桑椹菌核病菌中建立有效的CRISPR/Cas9基因编辑技术体系。

技术领域

本发明属于基因组编辑技术领域，涉及一种CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立方法及其应用，具体地说，涉及一种桑椹菌核病菌Scleromitrula shiraiana的CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立方法与应用。

背景技术

基因组编辑技术是新近发展起来的对基因组进行定向精确修饰的一种技术，主要包括人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(transcriptionactivator-like effector nucleases，TALEN)及RNA引导的CRISPR/Cas核酸酶(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)技术。基因组编辑技术在基础研究和动物、植物和微生物遗传改良等方面展示出了巨大的潜力，其中最新发展起来的CRISPR/Cas9技术，有着其他基因编辑技术无可比拟的优势，该系统只需设计和目标核酸对应的RNA序列，操作手段简单，效率高，成本低，为基因组编辑提供了新的平台。目前，CRISPR/Cas9系统作为一种高效的基因定点编辑技术，已成功应用于人类细胞、线虫、斑马鱼、果蝇、水稻、拟南芥等模式生物。在丝状真菌研究领域有关CRISPR/Cas9基因编辑体系的研究报道主要集中在曲霉属(Aspergillus)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、水稻稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)等。

桑椹菌核病又称白果病，目前公认且常见的菌核病有桑椹肥大型菌核病、桑椹缩小型菌核病和桑椹小粒型菌核病3种，病原菌分别为桑实杯盘菌(Ciboria shiraiana)、桑椹核地杖菌(Scleromitrula shiraiana)和肉阜状杯菌(Ciboria carunculoides)。菌核是桑椹菌核病菌越冬的重要场所，菌核随病椹落地，到次年3月上、中旬桑雌花开放时，土壤中的菌核萌发形成子囊盘。子囊盘上子实层着生子囊和子囊孢子，子囊孢子是病害初侵染的主要来源。因此，了解菌核形成相关的分子机制可以为病害防治提供理论依据。Chen等从核盘菌中克隆到一个高度保守的ERK-type丝裂原活化蛋白激酶编码基因(ERK-typemitogen-activated protein kinases from S.sclerotiorum,smk1)，该基因在菌核形成起始阶段的表达量达到最高，smk1基因沉默菌株不能形成成熟的菌核，其表达受到酸性诱导和外源环磷酸腺苷的抑制，说明smk1基因可通过MAPK途径能对环境信号作出反应并调控菌核的形成。专利发明人前期利用CodeHop设计的简并引物DMMK1-F/DMMK1-R，经RT-PCR扩增出特异片段，克隆获得856bp桑核地杖菌丝裂原活化蛋白激酶基因Mmk1的cDNA片段，Blastx比对发现Mmk1与核盘菌菌丝裂原活化蛋白激酶Smk1同源性为99％，系统进化树分析发现MMK1序列与Sclerotinia sclerotiorum和Botrytis cinerea的MAPK氨基酸序列聚为一类。