[发明专利]一种CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立方法及其应用

权利要求书

1.一种CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、sgRNA设计

根据前期克隆获得菌核形成相关基因Mmk1的序列如SEQ：ID：NO：1所示，并利用在线工具CRISPRdirecthttp：//crispr.dbcls.jp/，设计该基因的靶点序列如SEQ：ID：NO：2-SEQ：ID：NO：3所示；

步骤2、CRISPR/Cas9-Mmk1-sgRNA载体的构建

各取10μm正向M1-F和10μm反向引物M1-R10μl，混匀，94℃5min，5℃/2min的速率降温至50℃，10℃/2min降温至10℃合成双链DNA；用T4多聚核苷酸激酶对sgRNA合成的双链引物进行退火添加磷酸基团，反应体系15μl：合成的双链DNA 8μl，10×T4 PNK buffer 1.5μl，ddH₂O 4.5μl，T4 PNK 1μl，反应程序：37℃30min，65℃20min，-20℃保存；用限制性核酸内切酶Fast digest ESP3I酶切载体U6-2，酶切体系50μl：质粒DNA 5μg，ESP3I酶5μl，10×buffer 5μl，β-巯基乙醇稀释100倍2.5μl，37℃5min，65℃10min；并用DNA回收试剂盒回收DNA；最后将sgRNA寡聚核苷酸片段与载体用T4 Ligase进行连接，反应体系10μl：T4连接酶Buffer 1μl，T4连接酶1μl，CRISPR/Cas9质粒载体U6-24μl；sgRNA插入片段4μl，其中载体和插入片段摩尔浓度比在1∶3-10范围；反应条件：22℃连接1h；

步骤3、转化并筛选阳性克隆

从-80℃冰箱中取出大肠杆菌JM109感受态细胞悬液100μl的1.5ml离心管，放置冰上解冻10min，加入10μl连接产物，轻柔混匀后于冰上放置30min，42℃水浴90s，迅速置于冰上冷却2min，向离心管中加入890μl LB液体培养基，轻柔混匀后在37℃水平摇床中震荡培养过夜；将菌液在吸取100μl菌液涂布于含有AMP、IPTG和X-gal的抗性的LB固体培养基平板上37℃培养过夜；挑取白色克隆到含有相应浓度筛选药剂的LB液体培养基中，于37℃水平摇床中培养过夜，将菌液加入到1.5ml离心管，5000rpm，离心10min，去上清，于沉淀物中加入200μl的无菌去离子水，混匀，悬浮沉淀，悬浮液在100℃沸水中水浴加热10min，然后4℃放置5min，12000rpm，离心20min，取1μl上清液作为PCR的模板，采用设计的引物进行菌落PCR验证，所述引物序列如SEQ：ID：NO：4-SEQ：ID：NO：5所示，反应在50μl PCR体系中进行，包括2×Es Taq Mastermix 25μl，10μm引物各1μL，模板DNA 1μl，加入ddH₂O至体系体积达50μl；PCR扩增参数为：95℃4min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min，然后将阳性克隆和送样至擎科生物公司测序，与载体U6-2用Clustal X version 1.83进行比对发现靶标序列已经插入到阳性克隆中；

步骤4、原生质体的制备

将Cb1-6-24放至PDB培养基中，25℃，180rpm培养4d，称取三种裂解酶：锅牛酶、纤维素酶和溶菌酶各0.2g，将混合酶溶解在10ml的0.7M Nacl溶液中，用0.45μm的细菌滤器过滤酶液；将酶与三层擦镜纸过滤的菌丝体混合，30℃，100rpm，孵育3h，将裂解液用三层擦镜纸过滤，并用0.7M Nacl冲洗，收集滤液，10℃，5000rpm离心10min，弃上清留原生质体沉淀，用6ml 0.7M Nacl重悬原生质体沉淀并分装到2ml离心管中，10℃，5000rpm离心2min，弃上清，每管原生质体再用1ml的STC溶液重新悬浮，之后10℃，5000rpm离心2min，弃上清，最后用1ml的STC溶液重悬，并逐滴加入250μl的SPTC溶液，混匀后冰上放置待用；

步骤5、原生质体转化

用质粒提取试剂盒提取重组质粒，将80μl重组质粒的DNA和5μL的肝素钠5mg/mL加入1.25ml原生质体悬浮液中，轻轻混匀，冰上静置30min；逐滴加入1/3体积的SPTC溶液，轻轻混匀，在室温静置20min；将混合液转移到50ml玻璃三角瓶中，加入20ml的RM培养液，室温静置2小时后25℃，100rpm恢复培养过夜；将恢复好的1ml混合液涂布在含有30μg/mlAmp抗生素的PDA培养基中，25℃培养至长出转化子后，并挑取转化子接种在含有Amp 100μg/ml抗生素的PDA培养基中上进行再筛选；用DNA提取试剂盒提取转化子和菌株Cb1-6-24的基因组DNA，设计引物对转化子进行验证，所述引物序列如SEQ：ID：NO：6-SEQ：ID：NO：7所示，反应在50μl PCR体系中进行，包括2×Es Taq Mastermix 25μl，10μm引物各1μL，模板DNA 1μl，加入ddH₂O至体系体积达50μl；PCR扩增参数为：95℃4min；94℃1min，52℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min，然后送样至擎科生物公司测序，测序后序列比对结果表明，随机挑选5株转化子进行验证，所测得的靶位点序列附近均出现不同形式的突变。