[发明专利]一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物及其用途

说明书

本发明涉及一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物检测试剂，该生物标志物包括血液胞外囊泡miRNA生物标志物hsa‑miR‑628‑3p/hsa‑miR‑941和hsa‑miR‑584‑5p/hsa‑mir‑106b‑3p，作为区分肝细胞癌和非肝细胞癌的生物标志物。本发明首次提出并验证了血液外囊泡miRNA作为生物标志物表达水平区分肝癌患者时具有高敏感性和高阴性预测值，对于肝癌早期诊断具有重要意义。

技术领域

本发明涉及疾病早期检测技术领域，尤其涉及一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物检测试剂。

背景技术

原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，起源于肝细胞或肝内胆管上皮细胞，包括肝细胞癌、肝内胆管癌和混合细胞癌，其中75％-85％为肝细胞癌。由于肝细胞癌的侵袭性、生长快、起病隐匿，多数患者确诊时已为晚期，手术的效果大大降低，可供选择的治疗方法也很少。肝细胞癌的预后较差，患者五年生存率小于10％且复发率较高，可手术切除的早期患者五年生存率大幅度提高接近70％。肝细胞癌的主要危险因素包括乙型肝炎病毒(HBV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染、非酒精性脂肪肝疾病、黄曲霉毒素、饮酒等，在我国关键的决定因素是慢性HBV感染和黄曲霉毒素暴露。同时，80％-90％的肝细胞癌病例是发生在肝硬化背景下。并且对肝细胞癌伴随HBV感染和肝硬化的患者进行筛查和监测可以降低肝细胞癌患者的死亡率。因此，如何准确高效的对早期肝细胞癌患者进行鉴别诊断在临床上具有重要意义。

目前，肝细胞癌的诊断方法有胸部影像学、内窥镜超声引导下细针穿刺活检(EUS-FNA)以及甲胎蛋白(AFP)检测等，但这些方法的检测效果在对肝细胞癌诊断时均有一定的局限性。胸部影像学检查方法包括超声造影(CEUS)、CT、核磁共振成像(MRI)和PET-CT等，但影像学检测方法的灵敏度和特异性有限，CT和MRI仅当结节大于1-2cm时诊断价值较高。据报道对于大于2cm的肿瘤MRI的准确率为90％，在小于2cm的肿瘤中准确率降低到33％。而EUS-FNA是一种侵入性检测方法容易引起腹腔内的感染、出血和肿瘤扩散。AFP是基于血液的肿瘤标志物被广泛用于肝细胞癌的早诊和预后，据报道血清中AFP水平大于200ng/mL时对于伴随肝硬化的肝细胞癌患者诊断具有很高的特异性，但只有三分一的肝细胞癌患者血清AFP水平大于100ng/mL，而且AFP诊断的敏感性较低常漏诊早期小肿瘤的患者，无法作为有效的鉴别诊断标志物。因此，急需开发基于微创诊断方法的肿瘤标志物来提高肝细胞癌早期鉴别诊断的效果。

胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是由多种不同细胞释放到细胞外的囊泡，可分为多种类型。其中，一类小型胞外囊泡，又称外泌体，是一种直径约30-150nm的膜性囊泡。胞外囊泡是由核酸、蛋白质、脂质等组成几乎存在于所有的生物体液中。外周血中游离的胞外囊泡作为一种重要液体活检形式已得到广泛的关注和深入研究，近期，研究显示来源于血液胞外囊泡的miRNA被认为是一种潜在的诊断标志物应用于肝细胞癌的早期诊断。Won Sohn等人的研究证实与慢性乙肝和肝硬化组相比肝细胞癌患者血清胞外囊泡miR-18a、miR-221、miR-222、miR-224表达是显著性升高的。而Lin huajun等人的研究表明在与HBV感染和肝硬化组相比肝细胞癌患者血浆胞外囊泡miR-26a、miR-29c、miR-21表达是显著性下调的。然而，这些研究样本量较小、检测胞外囊泡miRNA的数量较少、或缺少独立的验证试验、基于芯片或RT-PCR技术无法发现胞外囊泡中未知的miRNA，导致缺乏来源于血液胞外囊泡的miRNA作为有效的生物标志物对肝细胞癌进行早期鉴别诊断。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提出一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物检测试剂，利用血液外囊泡miRNA作为生物标志物区分非肝细胞癌和肝细胞癌患者时具有高敏感性和高阴性预测值，能够辅助肝癌早期诊断。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括：