[发明专利]多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒

说明书

本发明提供了多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒，具体地本发明公开了一种基于实时荧光定量PCR技术平台，多重检测H1N1(2019)、H3N2、H5N1、H1N1、H7N9等甲型流感病毒，Yamagata、Victoria等乙型流感病毒，2019‑nCoV OFR1ab、N基因及人源内标基因GAPDH的方法、引物、探针及其试剂盒，具有检测操作简单、绝对定量、灵敏度高、特异性强及重复性好等优点。

技术领域

本发明属于生物技术和肿瘤诊断领域，具体地说，本发明涉及一种基于实时荧光定量PCR检测技术平台，定性检测人鼻咽拭子、咽拭子、痰液等样本中甲型流感病毒、乙型流感病毒及2019新型冠状病毒核酸检测的方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒。

背景技术

甲型流感病毒是由A型流感病毒(Influenza A)引起的一种人畜共患的疾病综合症。禽类感染Influenza A后，可出现从亚临床症状到轻度上呼吸道症状、委顿、乃至全身致死性疾病综合征。目前已有许多甲型流感病毒如H1N1、H3N2、H5N1、H9N2、H7N9等由禽类传播到人类中，死亡率极高，导致严重的公共卫生事件，不同型别的毒株感染在临床症状上高度类似，并且与造成流感样症状的其他病原也难以区别。监测是确定甲型流感流行株、发现变异株、预测和防控疫情的基础。因此，建立快速、准确、简单、高灵敏度的检测方法显得尤为迫切。

乙型流感病毒(Influenza B virus)是流感的主要病原之一，主要经飞沫及接触传播，人群普遍敏感。乙型流感病毒引起的症状特点是起病急骤，畏寒、发热，体温在数小时至24小时内升达高峰，39-40℃甚至更高；伴头痛，全身酸痛，乏力，食欲减退；呼吸道症状较轻，咽干喉痛，干咳，可有腹泻；颜面潮红，眼结膜外眦充血，咽部充血，软腭上有滤泡。乙型流感病毒根据抗原特性和血凝素(HA1)基因的核酸序列，可以分为不同的谱系。病毒大多数的谱系在自然选择中消失，目前演变成抗原性差异较大的两大谱系，分别称为Yamagata系和Victoria系(简称为Y系和V系)。

2019新型冠状病毒(2019-nCoV或SARS-CoV-2)，为不分节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Corona viridae)正冠状病毒亚科(Orthocoronamirinae)，根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科被分为四个属。该病毒对热敏感，56℃30分钟、75％乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒，氯已定不能有效灭活病毒。临床症状以发热、乏力、干咳为主要表现。鼻塞、流涕等上呼吸道症状少见。约半数患者多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。值得注意的是重症、危重症患者病程中可为中低热，甚至无明显发热部分患者起病症状轻微，可无发热，多在1周后恢复多数恵者预后良好，少数患者病情危重，甚至死亡。

甲型流感病毒、乙型流感病毒、2019新型冠状病毒均为呼吸道病毒。甲型流感病毒和乙型流感病毒是最常见的流感病原，感染者初期症状与2019新型冠状病毒感染症状极为相似，均会表现出发热、咳嗽等症状，因此难以从临床症状对患者进行准确的鉴别诊断。

目前，甲型流感病毒、乙型流感病毒及2019新型冠状病毒核酸常用的检测方法包括基于荧光PCR技术的单一病原体的检测技术、高通量测序法、恒温扩增等，荧光PCR技术检测特异性高、灵敏度强操作较为简单，但在对多个病原同时进行检测时常需分管进行针对性检测，不同病原体PCR扩增条件可能存在一定的差异，因此临床应用时需逐一排查，导致病原确定的周期加长，高通量测序技术虽然可同时对多种未知序列进行检测，但存在检测周期长、成本高昂且操作复杂、数据解读难等问题，而恒温扩增技术虽然检测时间短，但其检测设备并不成熟，临床试剂应用时需增够新型仪器才能进行配套检测。

因此，本领域迫切需要开发能够高效率检测、鉴别临床常见呼吸道病毒的方法以满足临床的需求。另外，有报道表明现有的临床使用的核酸检测试剂盒存在准确率较低的问题，因此需要开发具有较高的临床检测准确率的试剂盒产品。

发明内容