[发明专利]一种pyrG筛选标记循环利用的方法及应用

说明书

本发明公开了一种新的pyrG筛选标记循环利用的方法及其应用，属于生物技术领域。该方法可从真菌基因组中剔除pyrG筛选标记而不依赖于pyrG两端的同向重复序列，不会在基因组上残留多余重复序列片段，剔除pyrG的重组菌能再次作为出发菌株使用pyrG进行遗传转化，实现pyrG筛选标记的循环利用。本发明的pyrG循环利用方法适用于以乳清苷‑5’‑磷酸脱羧酶编码基因URA3/pyrG表达元件作为遗传筛选标记的真菌，操作简便易行，不影响菌株遗传背景和性状，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新的pyrG筛选标记循环利用的方法及应用。

背景技术

真菌是自然界的一大类真核生物。它们之中有的为人类提供了食物，有的成为对人类有益的工、农业菌种，也有对人类有害的致病种类。在功能基因组时代，遗传操作体系的建立对进一步利用有益真菌和防治真菌病害，都离不开对这些真菌开展研究和遗传操作。在遗传转化过程中，需要快速筛选到目标转化子，后续转化子的传代培养也要避免重组基因的丢失，保持转基因所获得的新的遗传特性。这些都必须依赖高效、特异的遗传筛选标记，利用特定的培养基，使真菌在特定的筛选压力下进行选择性培养。

乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因URA3/pyrG是一类常用的真菌遗传转化营养缺陷筛选标记，其编码产物是真菌尿嘧啶核苷酸合成过程中的关键酶，突变或敲除该基因使乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶失活或缺失，表现为尿苷或尿嘧啶营养缺陷，只能通过外源添加尿苷或尿嘧啶才能在培养基上生长。URA3筛选标记最早是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）转化中应用的，后来扩大应用到其他酵母科真菌的转化筛选，如白念珠菌（Candida albicans）（Botstein D et al. Gene, 1979, 8(1): 17-24；Struhl K et al.PNAS, 1979, 76(3): 1035-1039；Boeke JD et al. Molecular and General GeneticsMGG, 1984, 197(2): 345-346；Huang G, et al. PNAS, 2006, 103(34):12813-12818.）。由于尿嘧啶生物合成途径非常保守，在丝状真菌中也有相似的合成过程。黄曲霉（Aspergillus flavus）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）和土曲霉（Aspergillus terreus）等真菌中的pyrG基因都与酿酒酵母URA3基因同源，在遗传转化中也得到广泛应用（Nie X et al. J Agric Food Chem, 2016, 64(35):6772-6782；Du T etal. Fungal Genet Biol, 2019, 128:20-28；Christmann M et al. PLoS Genet. 2013,9(2):e1003275；Zhang MK et al. J Agric Food Chem, 2018, 66(21):5401-5409；Kobayashi T et al. Biosci Biotechnol Biochem, 2017, 81(5):1041-1050.）。