[发明专利]一种pyrG筛选标记循环利用的方法及应用

权利要求书

1.一种pyrG筛选标记循环利用的方法，其特征在于，以基因组上整合了乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶编码基因pyrG筛选标记的重组菌为出发菌，利用pyrG筛选标记整合位点上、下游DNA融合片段的同源重组和5-氟乳清酸负筛选来剔除重组菌中的pyrG筛选标记，使菌株能够再次作为出发菌循环利用pyrG筛选标记进行遗传转化；

所述出发菌为黄曲霉（Aspergillus flavus）；

所述pyrG筛选标记源于曲霉；

所述pyrG筛选标记整合位点上、下游DNA融合片段为包含pyrG筛选标记整合位点上游的核苷酸片段和pyrG筛选标记整合位点下游的核苷酸片段的融合核苷酸片段；

所述5-氟乳清酸负筛选为在培养基中添加5-氟乳清酸、尿苷和尿嘧啶来培养真菌，筛选pyrG基因缺失的尿嘧啶营养缺陷型菌株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）以pyrG基因缺失的尿嘧啶营养缺陷型黄曲霉为受体菌，以源于烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的pyrG基因表达元件作为筛选标记进行任一基因改造，获得基因组上整合有pyrG筛选标记的重组菌；

2）制备步骤1）中所述重组菌的原生质体，向原生质体细胞中导入pyrG筛选标记整合位点上、下游DNA融合片段，并在含有5-氟乳清酸、尿苷和尿嘧啶的培养基上培养，筛选剔除pyrG筛选标记的重组菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）以pyrG基因缺失的尿嘧啶营养缺陷型黄曲霉为受体菌，通过PCR法将需进行基因改造的任一DNA片段、同源重组臂及源于烟曲霉的pyrG基因表达元件一起构建融合片段，将该融合片段导入黄曲霉受体菌的原生质体，获得基因组上整合有pyrG筛选标记的重组菌；

2）制备步骤1）中所述重组菌的原生质体，通过PCR法构建包含步骤1）所述重组菌的pyrG筛选标记整合位点上、下游DNA片段的融合片段，将该融合片段导入重组菌原生质体，

并在含有2 mg/ml 5-氟乳清酸、1 mg/L尿苷和1 mg/L尿嘧啶的培养基上培养，筛选剔除pyrG筛选标记的重组菌，该重组菌再次作为出发菌循环利用pyrG筛选标记进行遗传转化。