[发明专利]重组表达载体、耗竭减少的嵌合抗原受体T细胞及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及重组表达载体、耗竭减少的嵌合抗原受体T细胞及其应用。本发明涉及一种利用基因编辑技术敲除健康人来源的T细胞PTPN2基因，以减少CD8⁺阳性T细胞耗竭，与CAR共表达于T细胞上，改善了对肿瘤的检查点阻断应答，促进有效的抗肿瘤免疫。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及重组表达载体、耗竭减少的嵌合抗原受T细胞体及其应用。

背景技术

肿瘤可以通过设置免疫检查点，直接或间接抑制细胞毒性CD8⁺T细胞的激活和功能，从而避开免疫系统。肿瘤微环境可以上调T细胞抑制受体的配体，如肿瘤细胞上的程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)可以抑制T细胞信号传递，促进T细胞的耐受性或衰竭。免疫检查点受体，包括PD-1和细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)，可以通过招募磷酸酶来抵消T细胞受体(TCR)和共刺激受体诱导的激酶信号，从而抑制T细胞反应的持续期。

CAR-T疗法，是通过基因工程对患者自身的免疫T细胞进行改造，插入识别癌细胞抗原的嵌合抗原受体(CAR)，使其具备攻击癌细胞的能力，然后输注回患者体内产生免疫应答，消灭癌症。然而在肿瘤微环境中抗原的持续刺激下，输注回患者体内的CAR-T细胞会变得反应迟钝，抑制受体越来越多，CAR-T细胞失去效应功能，产生T细胞耗竭现象。现有技术没有公开过导致T细胞衰竭的关键机制。

PTPN2是一种非受体型的酪氨酸磷酸酶，其属于第一类基于半胱氨酸的磷酸酶中的经典磷酸酶。PTPN2磷酸酶最初是从T细胞的cDNA文库当中克隆得到，因此也被称为T细胞磷酸酶(T-cell Protein Tyrosine Phosphatase,TCPTP)。PTPN2通过去磷酸化使TCR信号级联近端的酪氨酸激酶失活。PTPN2也拮抗T细胞功能、稳态和分化所需的细胞因子信号。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供上述重组表达载体的应用。

本发明的再一目的在于提供含有上述重组表达载体的、耗竭减少的嵌合抗原受体T细胞。

本发明的再一目的在于提供上述嵌合抗原受体T细胞的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述嵌合抗原抗体T细胞的应用。

根据本发明具体实施方式的重组表达载体，所述重组表达载体共表达sh-PTPN2-1序列与Trop2/PD-L1双特异性嵌合抗原受体的核苷酸序列，其中，sh-PTPN2-1序列能够敲除人源PTPN2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

SEQ ID No.1：

5'-CCGGC GCTATTACTACCTTTAATTCA TTTTTTG-3'；

SEQ ID No.2：

5'-AATTCAAAAAA AATTAAAGGTAGTAATAGCCC-3'。

根据本发明具体实施方式的重组表达载体，所述Trop2/PD-L1双特异性嵌合抗原受体由CD8、人源化抗Trop2、抗PD-L1单链抗体、跨膜区CD8TM、胞内区CD28、CD137和CD3ζ串联构成。

CD8的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGMALPVTALLLPLALLLHAARP

人抗Trop2单链抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.4所示：