[发明专利]一种精准定量检测转基因耐除草剂大豆ZH10-6的方法

说明书

本发明公开了一种精准定量检测转基因耐除草剂大豆ZH10‑6的方法，它是采用一对特异性的引物、带有荧光标记的探针及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在PCR反应前由微滴发生器将PCR体系分配到足够小的反应单元中，实现每个反应单元只有单个模板分子，在60℃左右对核酸进行PCR扩增，再采用泊松分布原理，根据阳性微滴与阴性微滴数的比例计算目标分子拷贝数，实现绝对定量分析，无需标准品，无需构建标准曲线。其结果鉴定通过微滴读取器读取阳性微滴以及阴性微滴的个数，并以外源基因与内标准基因拷贝数浓度的比值计算样品的转基因含量和转化体拷贝数。本发明的检测方法具有精准定量、高特异性、高灵敏度、快速、简便等优点。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及一种转基因产品的精准定量检测方法，具体说是一种基于数字PCR的转基因大豆ZH10-6精准定量检测方法，通过将体系溶液生成微滴，将PCR体系分配到足够小的反应单元中，实现每个反应单元只有单个模板分子，经PCR反应扩增后，由微滴读取器读取微滴并计算内外基因拷贝数浓度比值，实现精准定量检测转基因大豆ZH10-6的方法构建及其应用。

背景技术

转基因作物的发展突飞猛进，很多国家和地区均实施了标识管理措施，并设定了阈值。如欧盟等国实施强制性的转基因标签制度；美国和加拿大实施自愿性的转基因标签制度，我国目前对转基因产品实施强制标识制度，对转基因产品精准定量检测方法的研制至关重要。目前，转基因检测的方法主要是基于核酸检测的聚合酶链式反应（polymerasechain reaction，PCR）技术、核酸杂交技术和基因芯片技术；基于蛋白质检测的WesternBlot、酶联免疫吸附测定等。其中应用最广泛的是基于核酸检测的普通PCR方法和实时荧光PCR方法。我国已经研制了ZH10-6大豆的定性PCR检测方法标准，但是其数字PCR定量方法未见报道。相对于转基因成分定性PCR检测方法，定量PCR检测方法不仅可以检测产品含有的转基因成分，而且可以确定转基因成分的含量，更加有助于转基因产品的行政监管。

数字PCR（digital polymerase chain reaction，dPCR）是近年来在实时荧光PCR基础上发展起来的微量DNA分子定量检测新技术。dPCR是将PCR体系分配到足够小的反应单元中，实现每个反应单元只有单个模板分子进行PCR扩增，再采用泊松分布原理，根据阳性微滴与阴性微滴数的比例计算目标分子拷贝数，实现绝对定量。该方法降低了标准曲线对测量结果产生影响等问题，降低了基体效应，实现了PCR扩增的样品分离，消除了本底信号的影响，提高了低拷贝DNA的扩增灵敏度。相比实时荧光PCR，数字PCR 具有更好的测量独立性，且无需任何校准物，具有更高的特异性、灵敏度、精确性和稳定性。

转基因耐除草剂大豆ZH10-6是由中国农业科学院作物科学研究所研发的转G2-EPSPS基因和GAT基因耐除草剂大豆新品系。研发人采用农杆菌介导转化法，将整合有G2-EPSPS和GAT两个基因的独立表达载体DNA导入大豆受体中，通过多代筛选获得对草甘膦具有抗性的ZH10-6转化体，在我国具有重要产业化应用前景。本研究以ZH10-6转化体特异性序列为靶标，通过对引物探针浓度的优化确定了扩增体系，并对其特异性、灵敏度、准确度等进行测试，建立了微滴式数字PCR精准定量PCR检测方法，旨在为该转化体的安全评价、行政监管和知识产权保护提供重要的技术支撑。

发明内容

本发明克服了定性PCR检测转基因大豆ZH10-6技术只可定性无法定量的缺陷，提供一种精准定量检测转基因大豆ZH10-6的方法。本发明的目的是解决定量检测转基因大豆ZH10-6方法空缺的问题，具有快速、高效、精准定量检测等优势。

本发明的技术内容如下：

一种用于检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物及探针，其特征在于包括ZH10-6后一个插入位点5’端外源基因侧翼序列：