[发明专利]一种精准定量检测转基因耐除草剂大豆ZH10-6的方法

权利要求书

1.一种用于检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物及探针，其特征在于包括ZH10-6后一个插入位点5’端外源基因侧翼序列：

正向引物序列：5’-GCGGTTTCTTCAAATCCTATGG-3’

反向引物序列：5’-CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3’

探针序列：FAM-AATGCCACCTTCTGGCTCCTTCAAACAC-BHQ1；

内源基因Lectin基因序列：

正向引物序列：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’

反向引物序列：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’

探针序列：FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1。

2.一种采用权利要求1所述用于检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物及探针精准定量检测转基因耐除草剂大豆ZH10-6的方法，其特征在于如下步骤：

（1）转化体特异性引物序列：

正向引物序列：5’-GCGGTTTCTTCAAATCCTATGG-3’,

反向引物序列：5’-CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3’，

探针序列：FAM-AATGCCACCTTCTGGCTCCTTCAAACAC-BHQ1；

内参基因Lectin基因序列：

正向引物序列：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’，

反向引物序列：5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’，

探针序列：FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1；

（2）PCR反应体系：总体积为20 μL，包括BIO-RAD ddPCR Supermix for Probes 10 μL，10 µmol/L上游引物1 μL，10 µmol/L下游引物1 μL，10 µmol/L探针1 μL，25 ng/μL DNA模板1 μL，最终用无菌水补充至20 μL；

（3）微滴生成：将20 μL反应体系小心转移至微卡发生器，避免产生气泡，同时与微卡发生器相应位置加入微滴生成油70 μL，盖上垫片，放入微滴生成器中生成微滴，微滴生成后用移液器倾斜30-45度吸取40 μL反应产物，小心转移至数字96孔反应板中，170℃热封膜；

（4）PCR反应程序：94 ℃预变性热激活10 min，1个循环；94 ℃变性30 s，60 ℃退火1min，40个循环；98℃酶失活10 min，1个循环；

（5）结果分析：微滴数字PCR仪自动计算每个反应的拷贝数浓度、总微滴数和阳性微滴数，总微滴数大于10000以上视为有效结果，按照公式A=B/C×100%，计算出试样中转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列百分含量；公式中A为转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列百分含量，B为转基因耐除草剂大豆ZH10-6转化体特异性序列的拷贝数浓度，C为内参基因Lectin基因的拷贝数浓度。

3.权利要求1所述的用于检测转基因大豆ZH10-6的特异性引物及探针在用于ZH10-6快速定量高效筛查方面的应用。