[发明专利]一种检测作物中CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器

说明书

一种检测作物中CP4‑EPSPS蛋白的电化学免疫传感器，包括玻碳电极及识别元件，其玻碳电极表面经复合材料修饰，所述复合材料由石墨烯与富含氨基的PAMAM超声形成；以金标抗体作为识别元件，胶体金标记的单克隆抗体CP4mAb通过共价结合的方式连接于玻碳电极表面的复合材料上，经5％BSA封闭后构建电化学免疫传感器，本发明中，金纳米粒子的引入提高了电活性物质的固载量，放大检测信号，对耐除草剂蛋白CP4‑EPSPS的检测特异性和灵敏性均较高，操作简单，反应迅速，灵敏度高，稳定性好，实现对痕量CP4‑EPSPS抗原的定量检测，为转基因作物的高灵敏、定量分析提供了新思路。

技术领域

本发明属于抗除草剂蛋白的检测领域，具体涉及一种检测作物中CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器。

背景技术

截至2018年，转基因作物种植面积达1.971亿公顷，与1996年相比增加了100倍之多。在转基因作物的品系中，耐除草剂作物是转基因作物中的一个重要品系，是通过将外源的CP4-epsps基因插入到作物的基因组中构建而成，使作物对草甘膦农药有一定的耐受性。

转基因技术的迅速发展给农业生产带来便利的同时，也对环境产生一定的威胁，如转基因蛋白可通过根系释放到土壤中，使非靶标作物产生对草甘膦农药的耐药性。同时，转基因作物的非法种植及流转到超市的现象也时有发生，因而需要加强对转基因作物实时及有效的监控。

目前，用于检测转基因作物的方法是基于PCR的检测技术，如常规PCR法，Realtime PCR法等，该类方法定位于核酸水平的检测，其检测灵敏度高，但样品预处理获得DNA的过程及操作步骤繁琐，不适用于转基因作物的快速筛查；基于蛋白分析的检测方法，如ELISA法、蛋白芯片等，需要较长的孵育时间；而试纸条法操作简单，使用方便，但仅能提供定性或半定量的检测结果，同时也面临灵敏度提升困难的瓶颈。

电化学免疫传感器，将免疫学技术与电化学分析技术相结合，可实现对靶标待测物的定量分析，目前，该技术已应用于多种分析物的检测，如生物毒素、抗生素、致病菌、农药残留、癌症标记物等。

中国发明专利CN107356646公开了一种检测CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器，其采用介孔碳与胶体金的复合材料修饰电极，硫堇与抗体的混合液耦连于复合材料上，BSA封闭后用于CP4-EPSPS蛋白的检测，该方案仅以单一的目标蛋白样品为测定对象，无法对作物中的混合蛋白样品进行定量分析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测作物中CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器，通过以复合材料为基底材料修饰于电极表面，将胶体金标记的单克隆抗体CP4mAb通过共价结合的方式连接于复合材料上，提高了抗体的负载量及检测信号，操作简单，反应迅速，灵敏度高，稳定性好，能够实现对痕量抗原CP4-EPSPS的检测，为转基因作物的高灵敏、定量分析提供了新思路。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种检测作物中CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器，其包括玻碳电极和识别元件；所述玻碳电极表面经复合材料修饰，所述复合材料由石墨烯与乙二胺核的树状分子PAMAM超声形成；所述识别元件为金标抗体，其为胶体金标记的单克隆抗体CP4mAb，金标抗体通过共价结合的方式连接于玻碳电极表面的复合材料上，再由5％BSA对修饰电极的非特异性结合位点进行封闭。

优选地，所述乙二胺核的树状分子PAMAM溶于甲醇溶液，与石墨烯在N,N-二甲基甲酰胺中超声4h以上获得所述复合材料，所述石墨烯、N,N-二甲基甲酰胺和PAMAM甲醇溶液的质量体积比为石墨烯、N,N-二甲基甲酰胺和PAMAM甲醇溶液＝0.5-1：1：0.025-0.05，石墨烯单位为mg，N,N-二甲基甲酰胺和PAMAM甲醇溶液单位为mL。

又，所述玻碳电极表面用于修饰的复合材料用量为5-7.5μL，金标抗体的使用量为1.5-1.8μg。