[发明专利]一种检测作物中CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器

权利要求书

1.一种检测作物中CP4-EPSPS蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：

1)制备胶体金溶液

采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制得胶体金溶液，其为酒红色透明溶液，胶体金粒径20-40nm，最大紫外吸收峰在525nm；

2)制备金标抗体

取制备好的胶体金溶液，加入碳酸钾调pH至8.0，边搅拌边加入单克隆抗体CP4mAb，混匀，室温反应45-60min，加入体积分数1-3％的BSA封闭反应45-60min，离心去除沉淀中的游离金，再离心去掉上清液，沉淀用金标抗体保存液重悬，重悬液离心后去上清，再重悬，得到复合物AuNPs-mAb即金标抗体；

其中，单克隆抗体CP4mAb与胶体金溶液的质量体积比为60-72μg：1mL；

3)制备石墨烯-PAMAM复合材料

称取固体石墨烯粉末分散于N,N-二甲基甲酰胺中，超声处理至少4h，然后加入乙二胺核的树状分子PAMAM，室温超声处理至少30min，制得石墨烯-PAMAM复合材料；

4)组装电化学免疫传感器

将玻碳电极分别用粒径逐次减小的氧化铝粉多次抛光打磨至镜面，冲洗，依次在水、乙醇、水中超声，向玻碳电极表面滴加5-7.5μL石墨烯-PAMAM复合材料进行修饰，并在红外灯下干燥；

然后滴加戊二醛室温活化PAMAM中的氨基30-40min，将1.5-1.8μg金标抗体滴于经石墨烯-PAMAM修饰后的玻碳电极，进行反应结合，反应完毕后去除未结合的AuNPs-mAb，再滴加5-10μL含5％BSA的PBS溶液，封闭非特异性结合位点，得到所述电化学免疫传感器。

2.利用权利要求1所述方法制备得到的电化学免疫传感器，其包括玻碳电极和识别元件；其特征在于，所述玻碳电极表面经复合材料修饰，所述复合材料由石墨烯与乙二胺核的树状分子PAMAM超声形成；所述识别元件为金标抗体，其为胶体金标记的单克隆抗体CP4mAb，金标抗体通过共价结合的方式连接于玻碳电极表面的复合材料上，再由5％BSA对修饰电极的非特异性结合位点进行封闭。

3.根据权利要求2所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述乙二胺核的树状分子PAMAM溶于甲醇溶液，与石墨烯在N,N-二甲基甲酰胺中超声4h以上获得复合材料，所述石墨烯、N,N-二甲基甲酰胺和PAMAM甲醇溶液的质量体积比0.5-1：1：0.025-0.05，石墨烯单位为mg，N,N-二甲基甲酰胺和PAMAM甲醇溶液单位为mL。

4.根据权利要求2所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述玻碳电极表面用于修饰的复合材料用量为5-7.5μL，金标抗体的使用量为1.5-1.8μg。

5.根据权利要求2所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述金标抗体中，所述胶体金的粒径为20-40nm，单克隆抗体CP4mAb与胶体金溶液的质量体积比为60-72μg：1mL。

6.根据权利要求2所述的电化学免疫传感器，其特征在于，在储存33天后，仍保持90％以上的原始电流信号值，电流变化的相对标准偏差为0.31％。

7.根据权利要求2所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述电化学免疫传感器对RRS大豆的检出限为0.01％，对NK603玉米的检出限为0.03％。

8.如权利要求2-7任一项所述的电化学免疫传感器在转基因蛋白的定量检测中的应用。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于，通过差分脉冲伏安法，测定一系列浓度梯度标准品的最高电流值I，测定空白样品电流峰值I₀，以I-I₀值绘制标准曲线，检测样品的DPV值Is，将Is-I₀带入标准曲线中，获得样品中转基因蛋白的实际含量，实现转基因蛋白的定量检测。

10.如权利要求8所述应用，其特征在于，在含有[Fe(CN)₆]^3-/^4-和KCl的PBS缓冲液中，采用差分脉冲伏安法检测CP4-EPSPS蛋白，CV扫描范围为-0.2V～0.6V，扫描速率为50mV/s，以[Fe(CN)₆]^3-/^4-作为氧化还原探针。