[发明专利]核酸分子、载体、细胞和引物及其应用以及基于双重调控的植物高纯度克隆种子分选方法

说明书

本发明属于植物分子生物学和农业生物技术领域，具体涉及核酸分子、载体、细胞和引物及其应用以及基于双重调控的植物高纯度克隆种子分选方法，包括：将受E2调控的携带有花粉致死基因的筛选标记基因表达盒E1；花粉特异性调控表达盒E2；胚自主发生基因表达盒E3，经孤雌生殖得不含筛选标记的无性胚；创制MiMe突变体的基因编辑表达盒E4同时导入植物。E2调控基因表达，删除E1中识别位点之间的元件，调控筛选标记基因的表达，获得带有筛选标记的活性花粉，当识别无效时，花粉致死基因表达，使不带有筛选标记的花粉失活。本发明能在杂种后代中高效分选出固定了杂种优势的种子，并达到杂种优势利用一系法的产业化要求。

技术领域

本发明属于植物分子生物学和农业生物技术领域，具体涉及一种核酸分子，一种重组载体，一种转基因细胞，所述核酸分子、所述重组载体或所述转基因细胞的应用，一种引物，一种培育转基因植物的方法，一种鉴定所述转基因植物的方法，一种基于双重调控的植物高纯度克隆种子分选方法，以及一种筛选无融合生殖系的方法。

背景技术

一个完整的植株包括孢子体世代(2n)，它具有特定的生殖结构(花器官)，其中的雌蕊、雄蕊经过减数分裂和遗传重组，分别产生大孢子(1n)和小孢子(1n)；大、小孢子经过几次有丝分裂形成雌、雄配子体，雌配子体(胚囊)含有7个细胞(1个卵细胞、2个助细胞、1个具2核的中央细胞、3个反足细胞)并深埋于母体的胚珠组织中，雄配子体(花粉)含有1个营养细胞和2个精子；传粉后，花粉管进入胚囊，发生双受精作用，其中一个精子(雄配子)和卵细胞(雌配子)结合形成合子胚(2n)，另一个精子和中央细胞结合形成胚乳(3n)，由此完成一个生活周期，并开始新一轮孢子体世代。

无融合生殖是植物在由孢子体产生配子体的过程中不经过精卵细胞融合而产生胚和种子的生殖方式。包括单倍体无融合生殖和二倍体无融合生殖两种基本类型。二倍体无融合生殖由于能产生与母体植株基因型完全相同的后代，能固定任何优良的基因型，所以，特别受育种家们的重视，研究者们通常所指的无融合生殖育种也主要是专指这一类型，它包括：不定胚(Adventive embryony)生殖，无孢子生殖(Apospory)和二倍体孢子生殖(Diplospory)。

近年来植物生物技术飞速发展，通过分子生物学以及基因工程的手段去研究和改良作物在农业生产中取得了很好的应用前景。近期通过分子生物学以及基因工程的手段在无融合生殖研究领域取得了重要进展。2018年底，美国加州大学戴维斯分校VenkatesanSundaresan教授团队发表的水稻无融合生殖体系；通过编辑PAIR1、REC8、OSD1(MiMe)三个基因，结合卵细胞中异位表达 BBM1(Synthetic-Apomictic)，实现了水稻的无融合生殖。但是该无融合生殖体系中克隆种子的比率只达到29％，远低于生产上的纯度要求，且克隆种子和正常授粉受精而成的种子无法进行分选。以至于还无法实现杂交种无融合生殖体系的应用。

发明内容

本发明的目的在于解决上述背景技术中的不足，提供一种核酸分子，一种重组载体，一种转基因细胞，所述核酸分子、所述重组载体或所述转基因细胞的应用，一种引物，一种培育转基因植物的方法，一种鉴定所述转基因植物的方法，一种基于双重调控的植物高纯度克隆种子分选方法，以及一种筛选无融合生殖系的方法。本发明提供的方法基于双重调控能够提高克隆种子的高纯度分选，解决现有杂种优势固定分选技术不能获得纯度要求的克隆种子的问题，从而实现杂交种无融合体系应用的方法。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种核酸分子，该核酸分子包含表达盒E1，所述表达盒E1携带有筛选标记基因和花粉致死基因，所述表达盒E1经表达能够获得带有筛选标记的活性花粉，同时使得不带有筛选标记的花粉失活。

优选的，所述表达盒E1自上游至下游包括如下元件：胚特异表达启动子、第一调控位点、第一终止子、花粉特异表达启动子、花粉致死基因、第二终止子、第二调控位点、筛选标记基因和第三终止子；

其中，所述第一调控位点和第二调控位点的设置使得能够被酶识别，并切除第一调控位点和第二调控位点之间的元件。