[发明专利]核酸分子、载体、细胞和引物及其应用以及基于双重调控的植物高纯度克隆种子分选方法

权利要求书

1.一种核酸分子，其特征在于，该核酸分子包含表达盒E1，所述表达盒E1携带有筛选标记基因和花粉致死基因，所述表达盒E1经表达能够获得带有筛选标记的活性花粉，同时使得不带有筛选标记的花粉失活；

优选的，所述表达盒E1自上游至下游包括如下元件：胚特异表达启动子、第一调控位点、第一终止子、花粉特异表达启动子、花粉致死基因、第二终止子、第二调控位点、筛选标记基因和第三终止子；

其中，所述第一调控位点和第二调控位点的设置使得能够被识别，并切除第一调控位点和第二调控位点之间的元件；

优选的，所述胚特异表达启动子选自OsESP1、Ole18、OsVP1P和ZmESP，优选为OsESP1启动子，其序列优选如SEQ ID NO.2所示；

优选的，所述第一调控位点选自重组酶识别位点和双链断裂诱导酶识别位点；更优选的，所述第一调控位点自上游至下游为重组酶识别位点和双链断裂诱导酶识别位点，进一步优选为LoxP/FRT融合位点和双链断裂诱导酶I-SceI位点；更进一步优选的，所述LoxP/FRT融合位点的序列如SEQ ID NO.3所示；和/或，所述双链断裂诱导酶的序列如SEQ IDNO.4所示；

优选的，所述第一终止子为Nos终止子，所述Nos终止子的序列优选如SEQ ID NO.5所示；

优选的，所述花粉特异表达启动子为PG47；所述PG47启动子的序列优选如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.23所示；

优选的，所述花粉致死基因选自ZmAA1和Barnase，优选为ZmAA1，更优选的，所述ZmAA1基因的序列如SEQ ID NO.7所示；

优选的，所述第二终止子为IN2-1终止子，所述IN2-1终止子的序列优选如SEQ ID NO.8所示；

优选的，所述第二调控位点选自重组酶识别位点和双链断裂诱导酶识别位点；更优选的，所述第二调控位点自上游至下游为双链断裂诱导酶识别位点和重组酶识别位点，进一步优选为双链断裂诱导酶I-SceI位点和LoxP/FRT融合位点；更进一步优选的，所述LoxP/FRT融合位点的序列如SEQ ID NO.3所示；和/或，所述双链断裂诱导酶如SEQ ID NO.4所示；

优选的，所述筛选标记基因为荧光蛋白编码基因，优选为红色荧光蛋白编码基因，更优选为红色荧光蛋白基因DsRed2，所述DsRed2的序列优选如SEQ ID NO.9所示；

优选的，所述第三终止子为Nos终止子，所述Nos终止子的序列优选如SEQ ID NO.5所示；

优选的，所述表达盒E1包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

优选的，该核酸分子还包含表达盒E2，所述表达盒E2携带有调控基因，该调控基因能够识别所述第一调控位点和第二调控位点并切除第一调控位点和第二调控位点之间的元件；

优选的，所述表达盒E2自上游至下游包括如下元件：花粉特异表达启动子、调控基因和第四终止子；

优选的，所述花粉特异表达启动子为PG47；所述PG47启动子的序列优选如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.23所示；

优选的，所述调控基因选自重组酶系统、双链断裂诱导酶系统、基因组编辑系统和转座子系统，优选为重组酶系统，更优选为重组酶编码基因Cre，进一步优选的，重组酶编码基因Cre的序列如SEQ ID NO.11所示；

优选的，所述第四终止子为Nos终止子，所述Nos终止子的序列优选如SEQ ID NO.5所示；

优选的，所述表达盒E2包括如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；

优选的，该核酸分子还包含表达盒E3，所述表达盒E3携带有胚自主发生基因；

优选的，所述表达盒E3自上游至下游包括如下元件：卵细胞特异启动子、胚自主发生基因和第五终止子；

优选的，所述卵细胞特异启动子选自AtDD45、Os03g0296600pro、ECA1-like1 pro、DCL2、AT1G74480.1和ZmEAlpromoter；优选为AtDD45，AtDD45的序列优选如SEQ ID NO.13所示；

优选的，所述胚自主发生基因选自BBM1、WUS、LEC、CLAVATA和MYB115，优选为BBM1，BBM1的序列优选如SEQ ID NO.14所示；

优选的，所述第五终止子为Nos终止子，所述Nos终止子的序列优选如SEQ ID NO.5所示；

优选的，所述表达盒E3包括如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；

优选的，该核酸分子还包含表达盒E4，所述表达盒E4携带有产生MiMe突变体的元件，以促使有丝分裂替代减数分裂；

优选的，MiMe突变体中包括PAIR1、REC8和OSD1的突变，产生MiMe突变体的元件包括：如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的构建PAIR1突变的靶标序列，如SEQ ID NO.17和SEQID NO.18所示的构建PAIR1突变的靶标序列，如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的构建PAIR1突变的靶标序列。