[发明专利]检测番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1的KASP引物及其应用

说明书

本发明涉及分子生物学及作物育种技术领域，特别是指检测番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty‑1基因分型的KASP引物及其应用。番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty‑1在第3461碱基的位置存在一处SNP位点，该SNP位点碱基的突变导致Ty‑1基因抗性的改变。本发明基于该SNP位点设计了一组可用于基因分型的KASP引物和包含该KASP引物的试剂盒。本发明中的KASP引物和试剂盒可用于鉴定番茄中是否含有番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty‑1，区分含有Ty‑1的抗番茄黄化曲叶病毒病的番茄和不含有Ty‑1感番茄黄化曲叶病毒病的番茄。本发明相比现有技术可对番茄植株在苗期进行快速、准确、高通量的抗病性鉴定，降低苗期人工接种和田间抗病鉴定工作量，其应用可提高番茄育种效率、节约育种成本、加快育种进程。

技术领域

本发明涉及分子生物学及作物育种技术领域，特别是指检测番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1的KASP引物及其应用。

背景技术

番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)是茄科番茄属的一种一年生或多年生草本植物，起源于南美洲，是一种世界性的蔬菜作物，也是我国的主要栽培蔬菜之一。随着番茄栽培面积的扩大、栽培方式的多样化和连作障碍等影响，番茄病虫害也在不断加剧。近几年，由番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)引起的番茄黄化曲叶病毒病已成为全世界番茄生产上危害最严重的病害之一。感病植株初期上部叶片首先表现黄化型花叶，生长缓慢或停滞，节间变短，植株明显矮化。后期发病严重时植株生长停滞、矮化，开花后坐果困难，果实不能正常转色，损失达到100％。

培育抗TYLCV的新品种是防治此病的根本途径，随着番茄育种技术的不断进步，番茄已经由传统育种转向现代分子标记辅助的育种研究，分子标记辅助选择是对目标性状在DNA水平上的选择，不受环境影响，不受等位基因显隐性关系干扰，选择结果准确可靠。目前国际植物新品种保护联盟(UPOV)在BMT分子测试指南中，已将构建DNA分子标记的方法确定为SSR(Simple sequence repeats)和SNP(Single nucleotide polymorphism)标记。SNP标记作为第3代分子标记，目前被公认是极具应用前景的分子标记技术，基于SNP标记开发了许多稳定、高效的SNP分型技术如基因芯片、竞争性等位基因特异PCR(Kompetitive AlleleSpecific PCR，KASP)标记，已成功替代传统的SNP电泳分析，其中KASP技术具有高通量、省时、便捷的特点，其特点是基于引物末端碱基的特异匹配对SNP分型，可在广泛的基因组DNA样品中对SNP位点进行精准的双等位基因判断，具有高度稳定性与准确性，成为SNP基因分型的主流。其主要特征是引物采用3条特异性引物，其中上游引物2条，3’端为等位基因变异碱基，5’端添加通用荧光接头序列，通用的下游引物为普通引物，常规PCR扩增，终点法荧光信号检测。

目前，番茄抗黄化曲叶病毒病抗病基因主要有：Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4和Ty-5。几乎所有的抗病品种选育中Ty-1和Ty-3/Ty3a基因被认为是复等位基因，也是抗番茄黄化曲叶病毒病的最重要的基因，其抗病具有持久和稳定性，广泛应用于番茄抗黄化曲叶病毒育种中。因此利用KASP技术快速准确地鉴定番茄黄化曲叶病毒病的抗病基因Ty-1等可以大幅度提高新品种的选育效率，缩短育种年限。

KASP技术(竞争性等位基因特异性PCR)是目前国际上主流的基因分型方法之一，基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP和特定位点上的InDel进行精准的双等位基因判断。引物采用3条特异性引物，其中上游引物2条，3’端为等位基因变异碱基，5’端添加通用荧光接头序列，下游引物为普通引物，常规PCR扩增，终点法荧光信号检测。

KASP的特异性引物通常采用24bp-26bp，会有更高的特异性，对比常规酶切电泳准确率高；只需常规PCR扩增，所需时间短；无需昂贵的双色标记探针，灵活性超强；最低的DNA样本需求，无需全基因组扩增；快速高效，可以高通量检测大量样本的少数几个标记。

其主要操作步骤如下：