[发明专利]采用LC-MS/MS测定Demethoxydendrocandin S含量的方法

权利要求书

1.采用LC-MS/MS测定大鼠血浆及组织中Demethoxydendrocandin S含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)生物样品的处理：

取血浆样品或组织样品50μL加入10μL5μg/mL的内标溶液，再加入100μL乙腈沉淀蛋白，混匀，4000rmp/min离心5min后取上清后待用；

(2)标准曲线的制备：

将不同浓度的Demethoxydendrocandin S标准系列溶液分别加至空白大鼠血浆和组织样品中，取该血浆样品或组织样品50μL，依次加入内标溶液10μL，制备浓度为1.25～3125ng/mL的校准曲线样品，空白组织校准曲线样品浓度为1.25～400ng/mL；通过绘制峰面积比与分析物浓度的关系来确定校准曲线的线性度，并用在浓度范围内加权因子为1/c²的最小二乘回归对数据进行拟合；所述内标溶液浓度为5μg/mL，所述峰面积比由分析物/IS得到；

(3)LC-MS/MS测定：

通过液相色谱-串联质谱测定得到生物样品中的目标物质含量，根据进样所得数据，按所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中分析物Demethoxydendrocandin S的浓度；

(3a)色谱条件：所用的分析柱为SHISEIDO CAPCELL品牌的色谱柱，其规格为2.7μm，100×2.1mm I.D.；柱温30℃；流动相由A和B组成；反相高效液相色谱按体积比梯度：0-2min，A：70％；2-6min，A：70-55％；6-8.5min，A：55％；8.5-10min，A：55-70％，流速为0.3mL/min，每个样品的总运行时间为10分钟，注射体积为1μL；流动相A为水，流动相B为乙腈，反相为RP；

(3b)质谱条件：采用AB SCIEX Triple Quad 5500LC/MS/MS系统进行；离子源：ESI；正离子扫描，MRM：多反应离子监测；碰撞能量：－40ev；用于定量分析的离子反应：Demethoxydendrocandin S的m/z 461.3→251.1，内标的m/z 150.9→135.6；离子源参数：电离电压5500V，气帘气30psi，碰撞气8psi，所述气帘气和碰撞气均为氮气，加热辅助气50psi，排废辅助气50psi，气化温度500℃用于定量分析的离子反应：Demethoxydendrocandin S的m/z 461.3→251.1，内标的m/z 150.9→135.6。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所用的内标溶液为毛兰素溶液(IS)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，血浆样品的制备：从大鼠眼眶取出的静脉血，4℃下3000rmp离心10min，取上清，为血浆样本；组织样品的制备：组织与PBS缓冲液以1：4破碎、匀浆，4000rmp离心5min，取上清，为组织样本，所述1：4具体为1g组织：4mL PBS。

4.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，组织包括心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、脑、肌肉、脂肪、睾丸、子宫和卵巢。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述内标溶液的制备方法包括：取5mg的毛兰素，并且溶解于甲醇溶液，配制得到0.5mg/mL的毛兰素储备液，将所述储备液用甲醇溶液稀释成所述内标溶液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述校准曲线样品的制备方法包括：取50μg/mL的Demethoxydendrocandin S，并且溶解于等体积的甲醇溶液，配制得到Demethoxydendrocandin S储备液，将所述Demethoxydendrocandin S储备液用甲醇-水溶液稀释成梯度浓度为0.02～10μg/mL的校准曲线样品工作液，将所述校准曲线样品工作液用空白基质稀释成梯度浓度为1.25～3125ng/mL的所述校准曲线样品，所述空白基质为不含所述分析物与所述内标的大鼠血浆。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，标准曲线的制作：以Demethoxydendrocandin S比内标毛兰素的色谱峰面积比为纵坐标，以大鼠血浆中Demethoxydendrocandin S的浓度为横坐标制作标准曲线；待测样品根据所述标准曲线计算得到所述待测样品中的Demethoxydendrocandin S浓度。