[发明专利]一种基于二代测序的EGFR突变检测方法及试剂盒

说明书

本发明的目的是提供一种基于二代测序的EGFR突变检测方法及试剂盒，试剂盒包括特异性扩增EGFR片段的SEQ No.5、SEQ No.6、SEQ No.7、SEQ No.8、SEQ No.9、SEQ No.10、SEQ No.11、SEQ No.12引物组的引物混合液、多重PCR混合液、TE Buffer和纯化磁珠。本发明可对提取好的cfDNA进行PCR扩增、建库、测序，对样本中EGFR基因的第18外显子中的第2155、2156变异位点、第19外显子的缺失突变、第20外显子中2303~2369位点之间的突变和第21外显子2573~2582位点之间突变进行检测。本发明的试剂盒建库方法简单、操作简便，所需样本核酸量少，检测敏感度高，可用于cfDNA样本中EGFR基因突变检测。

技术领域

本发明为一种基于二代测序的EGFR突变检测方法及试剂盒。

背景技术

循环游离核酸（circulating cell-free nucleic acid，cfNA）是指存在于人体血液循环中的游离于细胞外的微量内源性或外源性核酸片段，cfNA 最早由Mandel和Metais于1947年发现，随后Leon等人的研究表明肿瘤患者外周血清DNA水平大大高于正常人。1989年Stroun等发现血液游离DNA具有肿瘤细胞DNA 的一些特征，5年后研究者在肿瘤患者的血浆和血清中检测到了癌基因突变，并且与原发肿瘤相一致。正常人循环血中存在少量游离DNA（浓度常小于10 ng/ml），肿瘤循环血DNA（circulating tµMour DNA，ctDNA）主要来源于肿瘤细胞,其血浆DNA浓度平均可达180 ng/mL。

靶向药物的出现从根本上改变了癌症的诊治，癌变相关基因变异检测用于预测肿瘤标记物变化在肿瘤患者管理中起着至关重要的作用。体细胞检测基因突变的局限性，促进了能精确地在异质混合物包括循环肿瘤DNA(ctDNA)中精确地测序遗传物质的新技术的发展。大多数肿瘤组织会将ctDNA的释放到循环血液中，ctDNA能够显示出肿瘤细胞的指纹特征, 并可以作为非侵入性生物标志物用于检测突变指导肿瘤个性化治疗、跟踪治疗反应或监测复发。因此，开发适用于肺癌，肝癌、胃癌，以及食道癌等患者的多重肿瘤液体活检试剂盒，将极大的促进肿瘤患者的分层管理和个性化治疗方案选择，解决目前临床的迫切需要。

目前，基于荧光PCR技术开发的单基因突变检测试剂盒价格高、敏感性低，只能进行单基因突变的检测，不适用于液体活检，需要的DNA样本量较高。基于目前NGS平台技术由于样本制备和测序过程中固有的碱基错配和测序错误，使得无法区分结果是测序错误还是突变，导致低检测灵敏度和准确性，此外，大多数基于NGS技术平台开发的试剂盒要求起始DNA样本量要150ng，致使这些试剂盒并不适用于肿瘤液体活检和检测突变频率为1-5%的低浓度样本。

NGS技术具有高通量的特性，能够一次检测多个基因的多个突变位点附近的序列，从而能够同时鉴别出已知和未知的突变类型，节省样本DNA用量，检测性价比高。因此，开发基于NGS技术的cfDNA基因突变的检测试剂盒，提高检测特异性和准确性，显著降低成本提高经济效益，对解决当前中国人群恶性肿瘤的预防和及早检测、管理治疗将起到很大的推动作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于二代测序的EGFR突变检测方法及试剂盒，其特征在于试剂盒包括：检测EGFR基因第18外显子SEQ No.1中的第2155、2156变异位点、EGFR基因第19外显子SEQ No.2的缺失突变、EGFR基因第20外显子SEQ No.3中2303~2369位点之间的突变和EGFR基因第21外显子SEQ No.4中2573~2582位点之间突变的特异性引物对（引物混合液）、多重PCR混合液、TE Buffer、纯化磁珠。