[发明专利]一种对酸敏感转座子插入突变体的反向筛选方法

说明书

本发明提供了一种对酸敏感转座子插入突变体的反向筛选方法，包括如下步骤：(1)转座子插入突变体库的构建；(2)杀菌型抗生素和酸联合处理；(3)细菌培养与单克隆挑取；(4)细菌耐酸表型验证。本发明所述的对酸敏感转座子插入突变体的反向筛选方法依赖于酸性环境对杀菌型抗生素的拮抗作用，这些抗生素能特异性地杀死复制活跃细菌，而对环境胁迫下生长受抑制的细菌的杀菌效果较弱。测试结果表明，获得的突变体对酸敏感率高达100％，方法简单有效，在革兰氏阴性代表菌阪崎肠杆菌和革兰氏阳性代表菌单核增生李斯特菌都得到了成功应用，为基因功能的研究提供新工具和新方法。

技术领域

本发明属于基因筛选领域，尤其是涉及一种对酸敏感转座子插入突变体的反向筛选方法。

背景技术

转座子(transponson,简称Tn),又称易位子，是指存在于染色体DNA上可以自主复制和位移的一段DNA序列。转座子可以在不同复制子之间转移，以非正常重组方式从一个位点插入到另外一个位点，对新位点基因的结构与表达产生多种遗传效应。现在的研究说明，在生物界中转座子是普遍存在的，并认为在生物的遗传进化方面有重要作用。转座子从一个位置转座到另一个位置的转入和切出过程，改变了原有基因的结构和排序，从而产生了突变。

转座子具有导致DNA随机诱变的作用，现已成为研究基因功能的重要手段之一，广泛的应用于构建突变体库和基因的标定。转座子具有可选择的抗性标记而容易在体内鉴定突变，经转座子诱变的突变子含有已知的DNA片段，可以通过转座子序列的杂交来鉴定突变基因的位置。经转座子诱变的突变体具有高度的极性，使得被诱变的基因以及同一操纵子内的下游基因完全丧失功能。

转座子突变可以迅速获得大量随机插入突变体，用于鉴定环境耐受基因、毒性基因、限速酶基因等研究目的。对于导致环境耐受的插入突变筛选往往很简单，可以在抗性培养基中培养，环境耐受菌株具有生长优势而被筛选出来。但是，有时野生型细菌本身对环境耐受，我们需要筛选环境耐受决定基因，就需要筛选对环境敏感的插入突变体并鉴定插入位置，这时，就需要进行大量克隆的筛选。

转座子突变已经广泛应用于致病菌的环境耐受与致病机制研究。食源性致病菌需要穿越胃部的酸性环境、进入肠道进而引起疾病。一般对酸敏感的细菌被认为不能够导致食源性疾病，因此，酸性环境耐受与食源性致病菌的致病能力密切相关，也正因为此，食源性致病菌的酸性环境耐受机制受到广泛关注与研究。酸性环境耐受机制需要获得突变体并且表型验证。转座子突变虽然可以迅速获得大量随机突变体，但导致酸性敏感的突变体一般不足万分之一，需要进行大量克隆筛选和表型验证。目前，没有已经报道的快速便捷的反向筛选酸性敏感菌株的有效方法。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种对酸敏感转座子插入突变体的反向筛选方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种对酸敏感转座子插入突变体的反向筛选方法，包括如下步骤：

(1)转座子插入突变体库的构建；

(2)杀菌型抗生素和酸联合处理；

(3)细菌培养与单克隆挑取；

(4)细菌耐酸表型验证。

进一步，所述的步骤(2)中的杀菌型抗生素为干扰细胞壁合成的抗生素或影响细菌蛋白质合成的抗生素中的一种；所述的杀菌型抗生素的浓度为50-1000mg/L。

进一步，所述的干扰细胞壁合成的抗生素为β-内酰胺类抗生素、万古霉素、替考拉宁或磷霉素中的一种；所述的β-内酰胺类抗生素为青霉素类抗生素或头孢菌素中的一种。

进一步，所述的影响细菌蛋白质合成的抗生素为氨基糖苷类抗生素。