[发明专利]一种高光学纯L-乳酸工程菌的构建方法

说明书

本发明涉及一种高光学纯L‑乳酸工程菌的构建方法，包括多个步骤，本发明选取拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei NCBIO01)作为出发菌株，参照其全基因组序列，基于CRISPR/Cas9基因编辑方法构建了pNcasA‑△ldhD敲除质粒，无痕敲除D‑乳酸脱氢酶(ldhD)的同时过表达一个L‑乳酸脱氢酶基因(ldhL)，得到一株高光学纯L‑乳酸工程菌，使其L‑乳酸光学纯度从原来的95.6％提高到99％以上，并且生产速率达到5.5g/L/h以上，成为潜在的工业L‑乳酸高效生产菌株。

技术领域

本发明涉及乳酸菌技术领域，具体涉及一株高光学纯L-乳酸工程菌及其构建方法。

背景技术

乳酸作为一种多用途的天然有机酸，广泛应用于食品、日用化工、制药、纺织、环保和农业等诸多领域。乳酸的生产方法主要有微生物发酵法和化学合成法，微生物发酵生产乳酸具有成本低、光学纯度高、操作容易、安全性高以及污染小等优点，因此受到科研人员广泛关注。近年来，人们通过L-乳酸聚合生成聚L-乳酸(poly lactic acid，PLA)，由于其生物相容性、可降解性以及无毒害作用等优良性能，能实现在生物圈中循环，是一种非常理想的高分子材料，在工业上具有广阔的应用前景。但是聚L乳酸的合成需要高光学纯度的L-乳酸作为前体物质，大多数同型乳酸发酵乳酸生产菌株具有较高的乳酸生产能力，但是会伴随着D-乳酸的生成，L-乳酸的光学纯度达不到合成聚乳酸的级别，必须通过下游的分离纯化步骤，加大了生产成本。

目前大部分乳酸生产菌株都是通过自然筛选和人工诱变获得，然而这些乳酸生产菌株在发酵过程中都存在一些限制性因素，例如同时存在L-乳酸脱氢酶和D-乳酸脱氢酶，产生L-乳酸和D-乳酸的异构体混合物，或者是异型乳酸发酵，乳酸光学纯度高，但副产物多，导致乳酸获得率低。随着分子生物学和基因组学、代谢组学的飞速发展，基因操作手段也越来越普及，人们可以通过对乳酸菌的定向基因编辑来获得所需性状的突变株。目前乳酸菌中应用最多的基因编辑方法是基于质粒的同源重组、单链DNA重组、Red/RecET介导的双链DNA重组等，但这些方法都操作复杂、耗时耗力，限制了乳酸菌代谢工程的发展，迫切地需要更高效更简便的方法。近年来，一种新型的基因编辑工具(CRISPR/Cas)，被成功应用到哺乳动物、植物及微生物中，极大了促进了功能基因组学及基因疗法的发展。利用该方法可以对目标基因进行点突变、基因敲除及基因插入，并且能精准定位到基因组的目标位置。拟干酪乳杆菌是一株同型乳酸发酵生产L-乳酸的高产菌株，并且在发酵过程中不易受杂菌影响，操作简单，拥有较高的工业应用前景。传统基因编辑方法对拟干酪乳杆菌改造效率低下，其CRISPR基因编辑技术亦尚未有报道，若能成功开发将极大提高拟干酪乳杆菌基因组编辑效率，从而服务于高性能乳酸菌的遗传改造，并扩展产物的应用前景。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一株高光学纯L-乳酸工程菌的构建方法，其具有让L-乳酸光学纯度提高的优点。

为实现上述目的，本发明提供一种高光学纯L-乳酸工程菌的构建方法，包括如下步骤，

步骤1：制备PCR体系50μl，取PCR扩增产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定成功后对PCR产物进行纯化回收；

步骤2：根据拟干酪乳杆菌ldhD基因序列，在ldhD基因CDS区上游设计sgRNA,通过引物ldhDsg-F/ldhDsg-R PCR扩增得到sgRNA片段，以拟干酪乳杆菌基因组为模板，用引物ldhDup-F/ldhDup-R、ldhDdown-F/ldhDdown-R分别PCR扩增出ldhD上游同源臂和下游同源臂各1000bp，以ldhL-F/ldhL-R引物PCR扩增出L-乳酸脱氢酶基因(ldhL)，以pan7-1质粒为模板，以Amp-F/Amp-R引物PCR扩增出氨苄青霉素抗性基因片段，