[发明专利]一种高光学纯L-乳酸工程菌的构建方法

权利要求书

1.一种高光学纯L-乳酸工程菌的构建方法，其特征在于：所述构件方法包括：

步骤1：制备PCR体系50μl，取PCR扩增产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定成功后对PCR产物进行纯化回收；

步骤2：根据拟干酪乳杆菌ldhD基因序列，在ldhD基因CDS区上游设计sgRNA,通过引物ldhDsg-F/ldhDsg-R PCR扩增得到sgRNA片段，以拟干酪乳杆菌基因组为模板，用引物ldhDup-F/ldhDup-R、ldhDdown-F/ldhDdown-R分别PCR扩增出ldhD上游同源臂和下游同源臂各1000bp，以ldhL-F/ldhL-R引物PCR扩增出L-乳酸脱氢酶基因(ldhL)，以pan7-1质粒为模板，以Amp-F/Amp-R引物PCR扩增出氨苄青霉素抗性基因片段；

步骤3：再用PCR将氨苄青霉素抗性基因片段、上游同源臂、ldhL基因、下游同源臂以及sgRNA融合，引物设计时需要使融合的片段之间存在20-40bp的重复区，五个片段融合的摩尔比为1:3:5:3:1，得到构建完成的质粒pNcas-△ldhD；

步骤4：将保存好的Lactobacillus paracasei甘油管在一级MRS茄子瓶涂布活化，37℃培养36h，然后将一级MRS茄子瓶菌体转接到二级茄子瓶中，37℃静止培养18h，将二级茄子瓶中的菌体用50mL的无菌水洗涤，在MRS平板中划线，37℃静置培养36h，挑取单菌落接种至MRS液体培养基中，37℃，110r/min过夜培养，按照5％的比例转接至50mL含有1％浓度甘氨酸的MRS液体培养基中，37℃,110r/min培养至OD620值为0.6，然后4500rpm，4℃离心10min收集菌体，电转缓冲液洗两遍，用1mL预冷的电转缓冲液重悬菌体，按每管80μL分装于1.5mL离心管中，冻存于-80℃，取100ng的pNcas-△ldhD质粒，将其与感受态细胞充分混合均匀，转移至冰上预冷的2mm电极杯中，进行电转化，快速加入37℃预热的复苏液MMRS，转移至离心管中，37℃复苏培养3h，涂布抗性平板，37℃培养48h，计算其转化效率；

步骤5：用具有氨苄抗性的MRS平板筛选含有pNcas-△ldhD质粒的转化子，然后挑取转化子单菌落过夜复苏培养，提取突变株基因组用ldhD特异性引物ldhD-F/ldhD-R进行PCR验证，通过PCR，核酸电泳跑出来的胶图和设计引物时的预期是一致的的转化子提供基因组送去生工生物测序，并将测序结果与源基因组比对，检验敲除结果，得到高光学纯L-乳酸工程菌。

2.根据权利要求1所述的高光学纯L-乳酸工程菌的构建方法，其特征在于：还包括有步骤6：150μL甘油管保藏的拟干酪乳杆菌菌液，均匀涂布于茄子瓶斜面培养基中，在37℃条件下，持续36h，连续活化培养两代，用50mL无菌水将活化菌株从茄子瓶斜面培养基中洗脱下来，之后接入15％v/v接种量的种子摇瓶培养基中，摇床在37℃，100r/min的条件下振荡培养12h左右，当OD620＝10后再接入20％v/v接种量的发酵摇瓶培养基中，摇床在37℃，110r/min的条件下振荡培养48h。

3.根据权利要求2所述的高光学纯L-乳酸工程菌的构建方法，其特征在于：还包括有步骤7：建立HPLC的方法对发酵产物中L-乳酸和D-乳酸对映体进行拆分，并检测发酵产物质中的比例，方法：采用手性柱phenomenx LC column色谱柱，流动相为0.002mol/L CuSO4·5H2O和5％异丙醇溶液，流速1mL/min，进样量5μL，检测波长254nm，柱温30℃，用化学纯的L-乳酸和D-乳酸作为标品制作标准曲线，然后将样品稀释到标准曲线的范围内进行检测。