[发明专利]一种牙髓组织间充质干细胞的消化分离方法

说明书

本发明提供了一种牙髓组织间充质干细胞的消化分离方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)获取牙髓组织；步骤2)分离培养牙髓组织间充质干细胞；步骤2.1)用眼科剪将步骤1获得的牙髓组织剪成0.5mm×0.5mm×0.5mm小块，加入1～3mg/ml的I型胶原酶、2～5mg/ml的中性蛋白酶和0.5～2mg/ml的胰酶，37℃中消化8～12min使牙髓组织松散。本发明的牙髓组织间充质干细胞增殖稳定性好，增殖数量大。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种牙髓组织间充质干细胞的消化分离方法。

背景技术

间充质干细胞具有多向分化潜能，可以修复损伤或缺失的组织，具有很大的临床应用潜力。牙髓干细胞属于间充质干细胞，而且是活性最强的间充质干细胞，活性是骨髓干细胞的3倍。少量牙髓干细胞就能分裂出千千万万细胞。分化能力非常强，在合适的体内或体外环境下可以分化成为骨细胞、脂肪细胞以及肝细胞等多种人体细胞，为组织、器官修复和移植提供了新的细胞来源。为深受疾病困扰的人们带来新的希望，并随着疾病研究范围扩大，将来糖尿病，脊髓损伤，中风，心脏瓣膜病，牙周病等都有望利用牙髓干细胞得到治疗。

目前，体外大规模的长期扩增培养是牙间充质干细胞临床应用的前提。然而，常规条件培养出的人牙髓干细胞贴壁慢、生长慢、细胞增殖能力下降、细胞衰老、干细胞特性降低、细胞分化能力减弱等缺陷。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种牙髓组织间充质干细胞的消化分离方法，该消化分离方法，牙髓组织间充质干细胞增殖能力高、更容易获得单一、纯化的大量原代细胞。

为实现上述目的，本发明实施例所采用的技术方案如下：

步骤1)获取牙髓组织；

步骤2)分离培养牙髓组织间充质干细胞；

步骤2.1)用眼科剪将步骤1获得的牙髓组织剪成0.5mm×0.5mm×0.5mm小块，加入1～3mg/ml的I型胶原酶、2～5mg/ml的中性蛋白酶和0.5～2mg/ml的胰酶，37℃中消化8～12min使牙髓组织松散；

步骤2.2)将步骤2.1中松散的牙髓组织，500r/min～700r/min，离心8～10min，弃上清液，加入培养液终止消化，吹打离散单细胞团块，形成的单细胞悬液，将单细胞悬液通过孔径为70μm的细胞筛网过滤；

步骤2.3)将步骤2.2)过滤后的单细胞悬液，800r/min～1000r/min，离心4～5min，弃上清液，用培养液将细胞重悬；

步骤2.4)将步骤2.3)中重悬后的细胞以1×103～2×103个/ml接种于培养液中，放于37℃、湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养24h，2～4天后半量换液，以后隔天换液。

进一步地，所述步骤2)分离培养牙髓组织间充质干细胞还包括：

步骤2.5)当细胞生长至80％～90％汇合时，用培养液传代培养。

进一步地，所述培养液为无血清培养液，包括表皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-4、神经肽Y以及MEM培养基。

进一步地，所述无血清培养液中：表皮细胞生长因子的含量为100～250μg/L，血小板衍生生长因子的含量为300～600μg/L，肝细胞生长因子的含量为8～12μg/L，成纤维细胞生长因子-4的含量为10～15μg/L，神经肽Y的含量为15～20ng/L，以及地塞米松1～15mM的MEM培养基。

进一步地，所述无血清培养液中：表皮细胞生长因子的含量为200μg/L，血小板衍生生长因子的含量为500μg/L，肝细胞生长因子的含量为10μg/L，成纤维细胞生长因子-4的含量为10μg/L，神经肽Y的含量为15ng/L，以及地塞米松5mM的MEM培养基。