[发明专利]一种牙髓组织间充质干细胞的消化分离方法

权利要求书

1.一种牙髓组织间充质干细胞的消化分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)获取牙髓组织；

步骤2)分离培养牙髓组织间充质干细胞；

步骤2.1)用眼科剪将步骤1获得的牙髓组织剪成0.5mm×0.5mm×0.5mm小块，加入1～3mg/ml的I型胶原酶、2～5mg/ml的中性蛋白酶和0.5～2mg/ml的胰酶，37℃中消化8～12min使牙髓组织松散；

步骤2.2)将步骤2.1中松散的牙髓组织，500r/min～700r/min，离心8～10min，弃上清液，加入培养液终止消化，吹打离散单细胞团块，形成的单细胞悬液，将单细胞悬液通过孔径为70μm的细胞筛网过滤；

步骤2.3)将步骤2.2)过滤后的单细胞悬液，800r/min～1000r/min，离心4～5min，弃上清液，用培养液将细胞重悬；

步骤2.4)将步骤2.3)中重悬后的细胞以1×10³～2×10³个/ml接种于培养液中，放于37℃、湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养24h，2～4天后半量换液，以后隔天换液。

2.如权利要求1所述的牙髓组织间充质干细胞的消化分离方法，其特征在于，所述步骤2)分离培养牙髓组织间充质干细胞还包括：

步骤2.5)当细胞生长至80％～90％汇合时，用培养液传代培养。

3.如权利要求2所述的牙髓组织间充质干细胞的消化分离方法，其特征在于，所述培养液为无血清培养液，包括表皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-4、神经肽Y以及MEM培养基。

4.如权利要求3所述的牙髓组织间充质干细胞的消化分离方法，其特征在于，所述无血清培养液中：表皮细胞生长因子的含量为100～250μg/L，血小板衍生生长因子的含量为300～600μg/L，肝细胞生长因子的含量为8～12μg/L，成纤维细胞生长因子-4的含量为10～15μg/L，神经肽Y的含量为15～20ng/L，以及地塞米松1～15mM的MEM培养基。

5.如权利要求4所述的牙髓组织间充质干细胞的消化分离方法，其特征在于，所述无血清培养液中：表皮细胞生长因子的含量为200μg/L，血小板衍生生长因子的含量为500μg/L，肝细胞生长因子的含量为10μg/L，成纤维细胞生长因子-4的含量为10μg/L，神经肽Y的含量为15ng/L，以及地塞米松5mM的MEM培养基。

6.如权利要求1所述的牙髓组织间充质干细胞的消化分离方法，其特征在于，步骤1)获取牙髓组织：取拿牙齿进行清洗、消毒后冷藏保存，冷藏保存45～47h后将牙齿挤压破碎，取拿牙髓组织，对牙髓组织进行清洗、消毒后将其置于离心管中。

7.如权利要求6所述的牙髓组织间充质干细胞的消化分离方法，其特征在于，将牙髓组织置于PBS缓冲液内进行反复清洗3～5次。