[发明专利]一种基于目标蛋白酶自身催化性质的检测方法

说明书

本发明公开了一种基于目标蛋白酶自身催化性质的检测方法，属于蛋白酶检测技术领域,选取与藻体生长相关的碳酸酐酶、碱性磷酸酶为目标蛋白,设计新型结构的DNA纳米器件作为探针，并结合蛋白酶自身的催化反应，将酶催化产物转化为单链DNA，从而通过单链DNA的测定来实现蛋白酶的检测，包括对碳酸酐蛋白酶的测定方法以及对碱性磷酸蛋白酶的测定方法。该基于目标蛋白酶自身催化性质的检测方法，通过设计DNA纳米探针，并对其进行优化以得到纳米探针，为制备电化学生物传感器对藻体生长相关酶的量的测定奠定基础，通过将蛋白酶的检测转换为DNA的测定，并结合Toehold介导的无酶DNA循环放大策略，建立新型灵敏的电化学生物传感器，克服传统方法中灵敏度低的问题。

技术领域

本发明属于蛋白酶检测技术领域，具体为一种基于目标蛋白酶自身催化性质的检测方法。

背景技术

随着工业和经济的飞速发展，水体污染问题日益突出。由于工业废水的肆意排放，导致80％以上的地表水、地下水被污染。据监测统计，中国达到三类水质可以进入自来水厂的最低要求的仅占29.5％，而劣五类水质却高达44％。另外，海域的形势也不容乐观，赤潮年年如期而至。近年来，各国越来越重视对水体污染物的治理。利用藻类的吸收、富集和降解作用去除污水中的营养物质、重金属离子和有机污染物是目前治理水质污染的新途径。该方法具有成本低、能耗小等优点。但是，水体藻类的异常生长(即赤潮现象)又会严重威胁水体的生态平衡，从而造成藻类污染。因此，在利用藻类治理环境的过程中，实时监测藻类的生长状况就显现的尤为重要。已有研究表明，藻体在疯狂生长之前，藻细胞将分泌大量的促进藻体生长的蛋白质(如碱性磷酸酯酶，碳酸酐酶)，因而研究者们把这些所分泌的酶的量作为来预测藻体的生长趋势的指标之一。目前，对蛋白质检测应用最多的方法是酶联免疫法，但是这种方法存在因检测时长、操作复杂、准确度低等问题。由于碱性磷酸酶和碳酸酐酶都对所对应的底物的化学反应具有高效的催化作用，因此，研究者基于目标蛋白酶自身的催化性质构建了一系列的检测方法：其中，测定碱性磷酸酶主要是通过碱性磷酸酶催化磷酸酯分子水解生成对特定的物质，反应达到终点时，采用光学、比色等方法对所生成的物质进行定量测定，从而直接通过催化产物的量来反应碱性磷酸酶的量。而这种方法准确度受到底物磷酸酯和产物的物理化学性质以及检测样品自身的颜色的影响，加之测试方法自身的准确度不高，使得检测的结果的可靠性差。测定碳酸酐酶主要是通过碳酸酐酶催化溶液中CO₂转换为HCO₃^-同时生成H⁺，采用pH计测定溶液的pH变化值从而来反应碳酸酐酶的量。这种方法受到测试体系的温度、pH计的灵敏度以及水体中杂志的干扰，使得测试体系不稳定，使得检测的结果的可靠性差。上述的方法在实际应用中依然存在一定缺陷，加之检测水体中目标酶的含量非常低且难于富集。