[发明专利]一种基于目标蛋白酶自身催化性质的检测方法

权利要求书

1.一种基于目标蛋白酶自身催化性质的检测方法，与藻体生长相关的碳酸酐酶、碱性磷酸酶为目标蛋白,设计新型结构的DNA纳米器件作为探针，并结合蛋白酶自身的催化反应，将酶催化产物转化为单链DNA，从而通过单链DNA的测定来实现蛋白酶的检测，其特征在于，包括对碳酸酐蛋白酶的测定方法以及对碱性磷酸蛋白酶的测定方法，

其中，对碳酸酐蛋白酶的测定方法包括以下步骤：

S1、基于碳酸酐酶的催化反应进行方案设计，碳酸酐酶的催化反应的方程式如下：

S2、设计对H⁺有响应作用的DNA探针作为H⁺的捕获探针；

S3、当有碳酸酐酶存在时，碳酸酐酶将会催化测试底液中的CO₂转化为HCO₃^-同时产生H⁺，所产生的H⁺将会去刺激所设计的DNA纳米探针，使DNA纳米探针发生构象变化，释放出两条有部分序列相同的DNA单链RS1和RS2，从而将碳酸酐蛋白酶的测定转换为DNA单链的测定；

S4、基于捕获探针和无酶DNA双循环放大策略构建电化学生物传感器的敏感界面；

S5、利用电化学生物传感器通过输出的电化学信号的大小可间接的测得碳酸酐酶的量；

其中，对碱性磷酸蛋白酶的测定方法包括以下步骤：

A1、基于碱性磷酸蛋白酶的水解反应进行方案设计，碱性磷酸蛋白酶的水解反应的方程式如下：

A2、选取步骤S2中设计的DNA纳米探针中的单链TS的5’端磷酸单酯作为碱性磷酸酶的催化底物，DNA纳米探针中其它单链DNA的5’都提前做去磷酸化处理，当没有碱性磷酸酶存在时，T4连接酶将会使DNA结构中的TS与RS之间生成磷酸二酯酶键，S2不能使DNA纳米探针发生构象变化，从而不能释放出TS和RS两条单链DNA，相反，在有碱性磷酸酶存在的情况下，碱性磷酸酶将会催化RS的5’的磷酸根水解，得到去磷酸化的DNA单链TS；

A3、所对应的DNA纳米探针将会在有S2存在时发生构象变化，释放出TS和RS两条单链DNA，成功的将碱性磷酸蛋白酶的测定转换为对DNA单链定量的测定；

A4、基于捕获探针和无酶DNA双循环放大策略构建电化学生物传感器的敏感界面；

A5、利用电化学生物传感器通过输出的电化学信号的大小可间接的测得碱性磷酸酶的量。

2.根据权利要求1所述的一种基于目标蛋白酶自身催化性质的检测方法，其特征在于，所述对碳酸酐蛋白酶的测定方法中，由于在藻体爆发式生长过程中，会使水中溶解无机碳的浓度降低，低浓度的溶解无机碳(DIC)将促使藻体细胞分泌大量碳酸酐酶以保证对CO₂的有效利用，维持藻体较快的生长速率，碳酸酐酶将催化胞内的CO₂转化为HCO₃^-,避免CO₂从胞内CO₂向外流失，在这一催化反应过程中，同时会有副产物H⁺生成。

3.根据权利要求1所述的一种基于目标蛋白酶自身催化性质的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中，捕获探针以邻位触及反应原理为基础，设计由三条DNA单链相互杂交而成的DNA纳米探针，利用DNA碱基可编码性，赋予所设计的DNA纳米探针对碱性磷酸酶/碳酸酐酶催化产物有响应作用。

4.根据权利要求3所述的一种基于目标蛋白酶自身催化性质的检测方法，其特征在于，所述DNA纳米探针中设计不同的互补碱基数，以电化学方法为辅助手段，优化DNA纳米探针的响应性能，并通过丙烯酰胺凝胶电泳分析、化学计算、原子力显微镜、投射电镜等手段，对DNA纳米探针进行表征。