[发明专利]基于特异性片段的灰略红链霉菌检测方法

说明书

一种基于特异性片段的灰略红链霉菌检测方法，通过从堆肥中提取细菌基因组DNA，经过细菌基因组PCR扩增和PCR产物的回收，经序列测定实现在堆肥过程中检测灰略红链霉菌；本发明可快速、高效、特异性检出环境中的秸秆降解灰略红链霉菌，为制备相关秸秆降解工程菌株奠定了基础。

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种秸秆降解生防功能的灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)的检测方法。

背景技术

现有堆肥发酵生产的关键因素之一是使用有效的微生物菌剂提高发酵效率。灰略红链霉菌JSD-1拥有木质素、纤维素、半纤维素降解酶，可以高效降解秸秆类难降解废弃物，有效提高堆肥温度，发酵周期可从常规的1～2个月缩短至8～10天。在好氧堆肥过程中，需要有效跟踪核心菌株-灰略红链霉菌的存活及迁移情况，以获得更好的菌剂施用效果。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于特异性片段的灰略红链霉菌检测方法，可快速、高效、特异性检出环境中的秸秆降解灰略红链霉菌，为制备相关秸秆降解工程菌株奠定了基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种基于特异性片段的灰略红链霉菌检测方法，通过从堆肥中提取细菌基因组DNA，经过细菌基因组PCR扩增和PCR产物的回收，经序列测定实现在堆肥过程中检测灰略红链霉菌。

所述的灰略红链霉菌，具体为灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD-1，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏标号为CGMCCNo.5706，保藏日期为2012年1月9日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学微生物研究所。

所述的序列测定，基于灰略红链霉菌的特异性片段实现，其来自灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD-1的全基因组，该特异性片段具体如Seq ID No.1～No.13所示。

所述的特异性片段，通过对灰略红链霉菌进行全基因组测序获得相应全基因组序列，基于Linux平台通过BLAST软件，将该基因组完成图与NT库序列进行比对，参照比对结果，挑选出1774条(100bp)相似度低于95％的序列，将这些序列再次与NT库进行二次比对，依此方法反复与NT库进行比对，查找到该菌特有的序列，获得该菌种的特有序列，即SEQIDNO.1～ NO.13作为所述特异性序列片段。

所述的全基因组测序是指：将冷冻保藏下的灰略红链霉菌 放入LB培养基培养24h，提取灰略红链霉菌总DNA，通过采用全基因组鸟枪法策略，构建不同插入片段长度的文库，采用Illumina Miseq测序平台对这些文库进行测序、拼接、组装，获得细菌基因信息，并对其进行功能基因注释。该灰略红链霉菌全基因组序列已上传NCBI网站，获得GenBank数据库注册号JJMG00000000。

为了保证结果更加精确，将比对的获得的13条特异性片段与NCBI数据库已有序列进行二次比对，对相似性较高的序列进行修剪，获得该菌种的特有序列。

附图说明

图1为实施例凝胶电泳结果示意图。

具体实施方式

本实施例涉及一种基于特异性片段的应用，即在堆肥过程中检出该灰略红链霉菌，具体步骤包括：

针对13条片段设计引物，获得13对引物片段。提取堆肥产物总DNA，含有本发明灰略红链霉菌的堆肥产物总DNA，本发明灰略红链霉菌，进行PCR扩增，反向验证，获得相应扩增条带，并对13条特异性片段测序。具体操作步骤如下：

步骤i)细菌基因组DNA的提取：