[发明专利]一种咖啡果小蠹的特异性SS-COI引物对、鉴定试剂盒和快速鉴定方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种咖啡果小蠹的特异性SS‑COI引物对、鉴定试剂盒和快速鉴定方法。该特异性SS‑COI引物对由SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物组成。本发明特异性SS‑COI引物和方法实现了对咖啡果小蠹的快速分子鉴定，方法简单，便于操作，耗时短；鉴定范围广、灵敏度高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种咖啡果小蠹的特异性SS-COI引物对、鉴定试剂盒和快速鉴定方法。

背景技术

咖啡果小蠹Hypothenemus hampei Ferrari，属鞘翅目(Coleoptera)、小蠹科(Scolytidae)、咪小蠹属(Hypothenemus Westwood)，是全球咖啡产业的头号害虫，已于2007年被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。其雌成虫在果实端部开始钻蛀，向内啃食形成不规则的坑道到达胚乳并产卵，整个历期不再飞出果实，终生与后代相伴；幼虫孵出后取食果肉和种子胚乳，待其羽化为成虫后可以同胞之间近亲交配生殖，随后雌成虫飞出坑道寻找新的果实钻蛀产卵。另外，该虫除为害咖啡外，还存在其他交替寄主，其中小部分交替寄主可为该虫提供完成整个生命周期的营养。因此，咖啡果小蠹钻蛀为害且存在交替寄主的特性造成防治十分困难，其每年给咖啡产业造成的损失为25％～80％。

2019年6月，中国热带农业科学院香料饮料研究所科技人员首次在我国海南省万宁市兴隆地区咖啡种植园中发现咖啡果小蠹入侵，现该虫已迅速蔓延至琼中县、白沙县和澄迈县等海南主要咖啡种植区。目前，除尼泊尔外，咖啡果小蠹已入侵全球所有咖啡主产国。

传统上，主要依靠外部形态学特征对咖啡果小蠹进行种类鉴定，由于同一生境中经常出现近缘种，需要昆虫分类专业人员和显微设备才能鉴别，存在鉴别难度大、耗时长等问题，不利于掌握该虫入侵扩散动态；而对于卵、幼虫、蛹及特征脱落的残体等样本，无法通过形态学特征进行鉴定。因此在检疫和监测过程中，传统形态学鉴定方法已不能满足实际工作需求。

近年来，随着分子生物学技术的发展及广泛应用，基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(mtDNA COⅠ)标记的分子鉴定技术已用于多种昆虫的种类鉴定，但该方法需要对PCR产物进行碱基序列测序以及系统发育分析，存在耗时、耗财、工作量大的问题。另外，限制性片段长度多态性(RFLP)和单链构象多态性(SSCP)等技术也常被用于昆虫种类鉴定，但其过程复杂，需要酶切、PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染等步骤，也存在耗时费力等问题。因此，为了解决目前咖啡果小蠹缺乏快速鉴定技术的问题，需要提供一种咖啡果小蠹特异性SS-COI引物及快速分子鉴定方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种咖啡果小蠹的特异性SS-COI引物对、鉴定试剂盒和快速鉴定方法。该特异性SS-COI引物和方法实现了对咖啡果小蠹的快速分子鉴定，方法简单，便于操作，耗时短；鉴定范围广、灵敏度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种咖啡果小蠹的特异性SS-COI引物对，由SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物组成。

本发明还提供了该特异性SS-COI引物对在制备鉴定咖啡果小蠹的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种鉴定咖啡果小蠹的试剂盒，包括上述特异性SS-COI引物对、Taq PCRMasterMixⅡ和ddH₂O。

本发明还提供了一种快速鉴定咖啡果小蠹的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)以待测样品的DNA为模板，采用上述试剂盒对DNA模板进行扩增；

(3)根据步骤(2)中扩增的结果判定待测样品中DNA模板是否来源于咖啡果小蠹；