[发明专利]重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的制备方法

说明书

本公开提供一种重组人胰高血糖素样肽‑1类似物融合蛋白的制备方法，以含有重组人胰高血糖素样肽‑1类似物融合蛋白的酵母工程菌发酵液上清为对象，在辛酸钠和氨甲环酸存在的条件下进行加热灭酶，减少了目的蛋白在分离纯化过程中的降解和生物活性损失，提高了注射用重组人胰高血糖素样肽‑1类似物融合蛋白的稳定性。

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种基因工程菌重组表达外源目的蛋白的分离纯化方法，更具体涉及一种重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的制备方法。

背景技术

胰高血糖素样肽-1（GLP-1）及其类似物例如Exendin-4被广泛的用来研究治疗2型糖尿病，由于GLP-1多肽在体内被蛋白酶二肽基肽酶Ⅳ(DPP-IV)所迅速失活，在血浆中的半衰期很短，使其难以在临床上被广泛使用；而Exendin-4对DPP-Ⅳ的酶降解不敏感，其稳定性增加，但分子量较低（4187.61D），在体内半衰期短，所以每天必须注射两次，这阻碍了在临床上使用。目前许多努力用来解决这个技术难题，例如缓释微球、PEG修饰，脂肪酸链修饰，白蛋白融合。其中白蛋白融合技术在保持目的蛋白的生物学和治疗功能的同时，通过与人白蛋白融合大大提高了其在体内半衰期。尽管GLP-1类制剂及其衍生物用于治疗糖尿病是现实可行的，但是因为糖尿病患者一经诊断后必须长期持续给药，终生接受治疗，因此对于该类制剂的安全性、经济性和使用便利性的要求都是极其迫切的。

Albugon是LaurieL.Baggio等设计的一种GLP-1/HSA融合蛋白，就是在其两者间插入一个额外的GLP-1分子作为间隔物，但其生物学活性仅仅保留了约1%；生物学活性的下降导致临床剂量的大幅增加（LaurieL.Baggio, Qingling Huang, Theodore J. Brown, andDaniel J. Drucker, DIABETES Vol.53：2492-2500 （2004））。GLP-1/HSA融合蛋白制剂临床剂量的增加不仅导致抗体生成的风险加大，而且还进一步推高了原本就高昂的重组GLP-1/HSA融合蛋白单位剂量生产和使用成本。

为解决上述问题，CN201310331182.6通过融合蛋白分子结构优化和设计，提供了与GLP-1/HSA融合蛋白更加稳定的GLP-1类似物融合蛋白。然而，上游的重组蛋白分子设计受限于结构-功能的构效关系，难以在确保功能的情况下消除全部降解位点。杨扬等通过对宿主菌进行基因工程改造，通过构建蛋白酶缺失的宿主菌来提高目的蛋白的表达和生物活性（“巴斯德毕赤酵母PEP4基因的剔除及对基因工程菌外源蛋白质表达的影响”，《食品与药品》 2007年第4期）。然而，宿主菌表达的酶种类繁多、酶合成代谢网络及调控复杂，通过基因改造的效果往往被宿主菌的代偿机制抵消，大规模的基因改造又可能影响对外源蛋白的表达能力。基于上述现有技术存在的不足，GLP-1类制剂生产制备过程中急需更多提高重组GLP-1融合蛋白稳定性、降低成本的方法。

发明内容

针对胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物融合蛋白生产过程中目的蛋白易降解、有效活性回收率低、融合蛋白产品不稳定的技术问题，本发明在上游优化重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白分子设计的基础上，对重组菌发酵、目的蛋白诱导表达、产物分离纯化等下游生产工艺进行系统分析和研究。首先，通过大量的前期分析，发现胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物融合蛋白的降解始于发酵末期、贯穿于整个生产工艺。进而，针对宿主菌蛋白酶和胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物融合蛋白在结构、生物活性、理化形状等方面的差异，尝试对发酵液进行预处理。最终，通过对预处理添加剂、理化条件等的优化，确定了在辛酸钠和氨甲环酸存在的条件下进行加热灭酶，减少了目的蛋白的降解和生物活性损失。

具体而言：

一方面，本发明提供一种重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的制备方法，包括工程菌构建、诱导表达、重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白纯化；