[发明专利]重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的制备方法有效
| 申请号： | 202010918389.3 | 申请日： | 2020-09-04 |
| 公开（公告）号： | CN111808201B | 公开（公告）日： | 2020-12-04 |
| 发明（设计）人： | 任杰;游猛;梅菲;方鹏;谭小钉;陆游;范敏;曹雨霞 | 申请（专利权）人： | 迈威（上海）生物科技股份有限公司;江苏迈威康新药研发有限公司 |
| 主分类号： | C07K19/00 | 分类号： | C07K19/00;C12N15/81;C12P21/02;C07K1/18;C07K1/22;C07K1/20;C07K1/16;C12R1/84 |
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| 地址： | 201210 上海市浦东新区自由贸*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 重组 人胰高 血糖 素样肽 类似物 融合 蛋白 制备 方法 | ||
1.一种重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的制备方法，包括工程菌构建、诱导表达、重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白纯化；
其特征在于，在诱导表达步骤和重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白纯化步骤之间包括将工程菌诱导表达的发酵液调节至pH 6.5-7.5之间进行预处理的步骤，所述预处理是在添加辛酸钠和氨甲环酸的条件下对工程菌诱导表达的发酵液68℃加热处理1h；
其中，辛酸钠和氨甲环酸摩尔比为1:1，终浓度分别为10-20mM。
2.如权利要求1所述的重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白包括GLP-1类似物、载体蛋白、可选的位于二者之间的蛋白接头。
3.如权利要求2所述的重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述GLP-1类似物如SEQ ID NO:1所示，所述载体蛋白为HSA，所述蛋白接头选自SEQID NO:2-4之一。
4.如权利要求2所述的重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白如SEQ ID NO:5所示。
5.如权利要求1所述的重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述诱导表达包括甘油培养阶段和甲醇诱导阶段；其中甘油流加培养至菌体湿重216-260g/L时，停止流加甘油，开始流加甲醇诱导发酵，直至发酵液中重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的表达量达0.3-0.7mg/mL。
6.如权利要求1所述的重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白纯化包括Blue Sepharose Fast Flow3.1L亲和层析、苯基琼脂糖疏水层析（Phenyl Sepharose High Performance）、DEAE琼脂糖阴离子层析（DEAE Sepharose Fast Flow）、以及G25脱盐层析。
7.辛酸钠和氨甲环酸在降低重组蛋白降解中的用途，其特征在于：将含有重组蛋白的酵母工程菌诱导表达发酵液上清调节至pH 6.5-7.5之间进行预处理，所述预处理是在添加辛酸钠和氨甲环酸的条件下对工程菌诱导表达的发酵液68℃加热处理1h；
其中，所述辛酸钠和氨甲环酸的摩尔比为1:1，终浓度分别为10-20mM；所述重组蛋白是重组人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白。
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