[发明专利]一种检测牛CART活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测牛CART活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法，包括如下步骤：S1、合成牛CART基因，亚克隆构建到表达载体pATX1上，哺乳系统表达目的蛋白，纯化后去内毒素，并标记生物素，制备出生物素标记的CART活性肽；S2、牛卵泡颗粒细胞膜碎片的获取；S3、通过BLItz单样本分子互作分析仪检测是否出现结合信号，从而检测牛卵泡颗粒细胞膜是否存在CART受体。本发明无需合成特定膜蛋白，可有效解决跨膜蛋白合成困难的问题，为鉴定CART受体及CART调控牛卵泡发育机理奠定基础，并为筛选神经肽受体提供思路。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测牛CART活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法。

背景技术

可卡因-苯丙胺调节转录肽（Cocaine - and Amphetamine - RegulatedTranscript Peptide，CART）是一种在牛卵泡发育过程中起负调控作用的神经肽，神经肽属于经典类激素，其对靶细胞的调控作用是通过其受体——靶细胞膜上的G蛋白偶联受体实现的。

已知神经肽受体除心房钠尿肽受体外，均为鸟核苷酸调节蛋白，即G蛋白偶联受体，由于G蛋白偶联受体为结构复杂的7次跨膜蛋白，故通过蛋白重组或合成，检测与其配体是否结合的方法不可行。

生物膜干涉技术（Biolayer Interferometry，BLI）可实时监控分子间的结合过程，该技术中抗原分子结合到光纤材质的生物传感器末端时形成生物膜，当抗原—抗体结合后生物膜厚度发生变化，此时，光通过传感器产生干涉光波，生物膜厚度是否变化通过干涉光波是否发生相对位移即可判断，干涉光波被光谱仪检测并形成干涉光谱，以干涉图谱的实时位移（nm）显示出来。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种检测牛CART活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法，通过特定传感器固化CART，然后与细胞膜碎片结合，通过干涉图谱实时位移（nm）的变化判断是否有结合信号，从而检测CART受体是否存在，无需合成特定膜蛋白，可有效解决跨膜蛋白合成困难的问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种检测牛CART活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法，包括如下步骤：

S1、合成牛基因，亚克隆构建到表达载体上，哺乳系统表达目的蛋白，纯化后去内毒素，并标记生物素，制备出生物素标记的活性肽；

S2、牛卵泡颗粒细胞膜碎片的获取；

S3、通过单样本分子互作分析仪检测是否出现结合信号，从而检测牛卵泡颗粒细胞膜是否存在CART受体。

进一步地，所述步骤S1具体包括如下步骤：

S11、取PCR管并标记，依次加入4 同源重组酶，5目的基因片段，1 线性化载体；吹打均匀后，置于预热的50℃ PCR仪中孵育45 min，得重组质粒；

S12、检测所得重组质粒的浓度及纯度，对纯度符合要求的质粒进行酶切，配制如下酶切体系：6 I内切酶，10 10×，50质粒；

将酶切混合物放入37℃水浴锅中酶切30 min，并混匀，酶切后，根据质粒体积加入0.75倍异丙醇，混匀，4℃离心30 min后弃上清，加入1 mL 70%乙醇4 ℃离心5 min，进行回收；

S13、将质粒瞬时转染到细胞中，收集培养基和细胞，直至存活率下降到50%以下，具体操作如下：

（1）转染前一天，接种27×10⁶个细胞到完全培养基中培养；