[发明专利]一种检测牛CART活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法

权利要求书

1.一种检测牛活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、合成牛基因，亚克隆构建到表达载体上，哺乳系统表达目的蛋白，纯化后去内毒素，并标记生物素，制备出生物素标记的活性肽；

S2、牛卵泡颗粒细胞膜碎片的获取；

S3、通过单样本分子互作分析仪检测是否出现结合信号，从而检测牛卵泡颗粒细胞膜是否存在CART受体。

2.如权利要求1所述的一种检测牛活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法，其特征在于：所述步骤S1具体包括如下步骤：

S11、取PCR管并标记，依次加入4 同源重组酶，5目的基因片段，1 线性化载体；吹打均匀后，置于预热的50℃ PCR仪中孵育45 min，得重组质粒；

S12、检测所得重组质粒的浓度及纯度，对纯度符合要求的质粒进行酶切，配制如下酶切体系：6 I内切酶，10 10×，50 质粒；

将酶切混合物放入37℃水浴锅中酶切30 min，并混匀，酶切后，根据质粒体积加入0.75倍异丙醇，混匀，4℃离心30 min后弃上清，加入1 mL 70%乙醇4 ℃离心5 min，进行回收；

S13、将质粒瞬时转染到细胞中，收集培养基和细胞，直至存活率下降到50%以下，具体操作如下：

（1）转染前一天，接种27×10⁶个细胞到完全培养基中培养；

（2）稀释15 DNA 至1.5 mL 完全培养基中，轻柔混匀，另稀释45 PEI转染试剂至1.5 mL完全培养基中，轻柔混匀，各自室温孵育5 min；

（3）将稀释后的PEI 加入稀释后的DNA中，此时转染混合物总体积为3 mL，轻柔混匀，室温孵育25 min；

（4）将3 mL转染混合物加入27 mL细胞悬液中，轻柔混匀，37 ℃， 5% CO₂， 130 rpm条件下培养10 d，至细胞活率降到50%以下收样；

S14、CART蛋白160 mL放大及纯化

（1）对表达结构进行无内毒素DNA制备，采用去内毒素质粒提取试剂盒；

（2）亲和蛋白A树脂的纯化；

（3）清洗树脂：根据树脂用量选择10倍树脂体积 binding buffer （PBS pH 7.5）清洗；

（4）上样：将收集的上清样品过柱，此过程缓慢进行，加速时必须控制速度：1 s/滴；

（5）淋洗：用PBS pH 7.5淋洗结合液，结合液通过自身重力向下滴，控制速度在1 s/滴；

（6）用20 mM柠檬酸pH 2.7缓冲液进行洗脱，缓慢进行；

（7）中和缓冲液：1 M Tris-HCl pH 9.0，每个淋洗的样品取样跑SDS-PAGE胶，IN 和FT上样量为10，其他上样量为20 ；

（8）将E1 - E6组分混合，进行缓冲液交换和浓缩，蛋白终浓度为：1.7 mg/mL，总蛋白量：500 ；

S15、生物素标记CART

将生物素使用DMF溶解，浓度20 mg/mL，并将抗体溶解于PBS，使用CBS调至pH 8.5，终浓度1-10 mg/mL；

按每mg抗体加5 生物素溶液，室温避光搅拌2 h，收集反应物使用PBS透析过夜，中途更换PBS 3-4次，经生物素标记后终浓度：0.1 mg/mL，总蛋白：495 。

3.如权利要求1所述的一种检测牛CART活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法，其特征在于：所述步骤S2具体包括如下步骤：

收集牛卵泡颗粒细胞，600 g离心5 min，4 ℃PBS缓冲液漂洗细胞两次，加入1 mL冷的细胞裂解液并收集细胞，移至EP管，反复吹打，1000 g 3min离心，将上清移至另一新EP管，21,460 g 1 h 4℃离心，收集沉淀，加入1 mL PBS后反复吹打，得到细胞膜碎片，所述细胞裂解液包括50 mM Hepes、150 mM NaCl、3 mM MgCl₂。

4.如权利要求1所述的一种检测牛CART活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法，其特征在于：所述步骤S3具体包括如下步骤：

在BLItz Pro 1.3系统中操作，反应体积300 μL，实验方法如下: (1) 基线平衡：将SA传感器放入PBS中浸湿10 min，在系统中进行第一次基线平衡，时间60 s；(2) CART固定：将传感器伸入含有生物素标记的终浓度为0.1 μg/μL的CART溶液中，时间300 s；(3) 基线平衡：将传感器伸入PBS中进行第二次基线平衡，时间240 s；(4) 结合测定：将传感器移至包含膜碎片的PBS溶液中进行结合测定，时间300 s；(5) 蛋白解离：将结合后的探针再次转移到PBS中进行解离实验，时间300 s。