[发明专利]严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒的制备、纯化和鉴定方法

说明书

本发明提供严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：将pFastBacDual双表达载体改造为三表达载体，将SARS‑CoV‑2的M、S、E基因进行密码子优化，然后将密码子优化的M、S基因依次分别构建至多角体蛋白pPH启动子后，将E基因构建至pP10启动子后，获得表达EMS重组质粒；将EMS重组质粒转化至DH10 Bacsupgt;TM/supgt;大肠杆菌中，经蓝白筛选挑取白色阳性克隆，提取杆粒转染ExpiSf9supgt;TM/supgt;细胞，胞内共表达E、M、S结构蛋白，自组装形成病毒样颗粒。本发明成功构建了EMS三表达载体，并利用杆状昆虫系统在ExpiSf9supgt;TM/supgt;细胞内成功表达了SARS‑CoV‑2VLPs。

技术领域

本发明涉及严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)的制备、纯化和鉴定方法。

背景技术

自21世纪以来，全球已出现三次冠状病毒爆发流行。相比严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸道冠状病毒(MERS-CoV)，严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)传播更快，传染指数2.6左右，目前对于SARS-CoV-2引起的冠状病毒病2019(COVID-19)没有特效药物，疫苗是预防和控制传染病的最有效和最经济的方法，急需开发针对SARS-CoV-2的疫苗，以预防和控制该病毒的传播。世界卫生组织估计，目前约有133种疫苗正在研制中。

目前冠状病毒疫苗形式多样，包括灭活病毒或减毒活病毒、基于蛋白质的疫苗、核酸疫苗等。灭活病毒或减毒活病毒需要在生物安全等级3(BSL3)条件下大量培养病毒，并需要进行广泛的安全测试，过程昂贵，费力且安全风险高。基于蛋白质的亚单位疫苗由于靶蛋白的不正确折叠或向免疫系统的展示不佳，使得一些亚单位疫苗的免疫原性很差。核酸疫苗无法有效地进入细胞，需要在注射后进行电穿孔，并且mRNA不是非常稳定，并需要多次接种。作为一类特定的亚单位疫苗，病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)能够模拟病毒天然形态结构，并具有不含病毒基因组核酸、无法复制、个体重复接种等特性。VLPs由于其强大的免疫原性，引发保护性中和抗体的能力以及可靠的安全性，因此可用于重组疫苗开发，有广阔的市场应用前景。目前已成功上市基于VLPs的有HPV疫苗和乙肝疫苗。

SARS-CoV-2基因组的3′端编码4种主要结构蛋白，包括刺突(S)蛋白，核衣壳(N)蛋白，膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白，根据以往研究，SARS-CoVVLPs、MERS-CoVVLPs的构成同时需要E、M、S三种蛋白。在本发明中，构建了同时表达E、M、S三种蛋白的EMS载体，利用Bac toBac杆状病毒昆虫表达系统，在ExpiSf9^TM细胞内实现E、M、S三种蛋白的共表达，并在细胞内自组装形成VLPs。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)的制备、纯化和鉴定方法。

本发明提供严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)、将pFastBacDual双表达载体改造为三表达载体，将SARS-CoV-2的M、S、E基因进行密码子优化，然后将密码子优化的M、S基因依次分别构建至多角体蛋白启动子后，将E基因构建至pP10启动子后，获得表达EMS重组质粒；

(2)将EMS重组质粒转化至DH10 Bac^TM大肠杆菌中，经蓝白筛选挑取白色阳性克隆，提取杆粒转染ExpiSf9^TM细胞，胞内共表达E、M、S结构蛋白，自组装形成病毒样颗粒。

作为优选，所述将pFastBacDual双表达载体改造为三表达载体是依次在pFastBacDual载体多克隆位点MCS2后，插入pPH启动子、多克隆位点MCS3及SV40 polyA尾，改造成三表达载体。