[发明专利]低毒力黄瓜花叶病毒载体、构建方法及应用

说明书

本发明公开一种低毒力黄瓜花叶病毒载体、构建方法及应用，所述低毒力黄瓜花叶病毒载体包括2b基因序列缺失的pCB‑CMVF209‑no2b序列、以及连接至所述pCB‑CMVF209‑no2b序列中氨基酸编码序列9‑17aa，所述9‑17aa的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列中至少27个连续的碱基。本发明提供的低毒力黄瓜花叶病毒载体可侵染普通栽培烟草为代表的寄主植物且不表现毒力症状。

技术领域

本发明涉及载体构建技术领域，具体涉及一种低毒力黄瓜花叶病毒载体、构建方法及应用。

背景技术

黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)寄主范围广泛，并且有多种株系，在不同种植物上产生严重程度不同的症状。现有技术中，已通过黄瓜花叶病毒开发出多个病毒表达载体。但现有的CMV病毒表达载体中，部分病毒载体仅可在个别物种的寄主植物上表达，对部分寄主物种植株不能系统侵染。例如：Matsuo K等、向志丹等开发了一种完全删除2b基因序列的CMV载体，只能用于系统侵染本氏烟植株和拟南芥植株，对寄主植物不表现症状，但系统侵染普通栽培烟草(Nicotiana tabacum)植株病毒含量低甚至不能检测到病毒。另外一些CMV病毒表达载体则对寄主物种的植株会产生毒力症状。程晓东等开发了一种缺失90个碱基的2b基因序列的CMV载体。WANG等开发了一种CMV载体保留2b蛋白80氨基酸的基因序列，但这两个保留2b基因序列的CMV载体在接种普通栽培烟草后会产生毒力症状。

因此有必要提供一种新型的低毒力黄瓜花叶病毒载体，以解决上述技术问题。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种低毒力黄瓜花叶病毒载体、构建方法及应用，以解决现有黄瓜花叶病毒载体不能侵染普通栽培烟草且不表达毒力症状的技术问题。

为实现上述目的，本发明提出的低毒力黄瓜花叶病毒载体，所述低毒力黄瓜花叶病毒载体包括2b基因序列缺失的pCB-CMVF209-no2b序列、以及连接至所述pCB-CMVF209-no2b序列中的氨基酸编码序列9-17aa，所述9-17aa的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列中至少*个连续的碱基。

优选地，所述低毒力黄瓜花叶病毒载体还包括多个连接至所述pCB-CMVF209-no2b序列中的多克隆酶切位点序列，所述多个多克隆酶切位点序列包括Mlu I、Spe I、Apa I、Sma I、Ava I、BamH I和Sac II中的至少一个以及Stu I。

本发明还提供了一种低毒力黄瓜花叶病毒载体的构建方法，包括：

步骤一、取原始pCB-CMVF209质粒，将含有氨基酸编码序列9-17aa的引物对原始pCB-CMVF209质粒进行扩增，并对扩增产物进行酶切以使2b基因序列缺失，制备得到2b基因序列缺失且具有氨基酸编码序列9-17aa的PCR产物的酶切产物；

步骤二、将含有多克隆酶切位点序列的引物对原始pCB-CMVF209质粒进行扩增，并以所述多克隆酶切位点序列对应的内切酶对扩增产物进行酶切，制备得到含有所述多克隆酶切位点序列的PCR产物的酶切产物；

步骤三、酶切原始pCB-CMVF209质粒，获得大片段产物；

步骤四、取连接酶将所述步骤一中制备的酶切产物、所述步骤二中制备的酶切产物、以及所述步骤三中制备大片段产物连接，制备得到如上述的低毒力黄瓜花叶病毒载体。

优选地，所述步骤一包括：

取原始pCB-CMVF209质粒，以NcoIF引物和2aORF1R引物扩增，其中，所述NcoIF引物含有Nco I酶切位点序列，所述2aORF1R引物含有Stu I酶切位点序列和氨基酸编码序列9-17aa；