[发明专利]低毒力黄瓜花叶病毒载体、构建方法及应用

权利要求书

1.一种低毒力黄瓜花叶病毒载体，其特征在于，所述低毒力黄瓜花叶病毒载体包括2b基因序列缺失的pCB-CMVF209-no2b序列、以及连接至所述pCB-CMVF209-no2b序列中的氨基酸编码序列9-17aa，所述9-17aa的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列中至少27个连续的碱基。

2.如权利要求1所述的低毒力黄瓜花叶病毒载体，其特征在于，所述低毒力黄瓜花叶病毒载体还包括多个连接至所述pCB-CMVF209-no2b序列中的多克隆酶切位点序列，所述多个多克隆酶切位点序列包括Mlu I、Spe I、Apa I、Sma I、Ava I、BamH I和Sac II中的至少一个以及Stu I。

3.一种低毒力黄瓜花叶病毒载体的构建方法，其特征在于，包括：

步骤一、取原始pCB-CMVF209质粒，将含有氨基酸编码序列9-17aa的引物对原始pCB-CMVF209质粒进行扩增，并对扩增产物进行酶切以使2b基因序列缺失，制备得到2b基因序列缺失且具有氨基酸编码序列9-17aa的PCR产物的酶切产物；

步骤二、将含有多克隆酶切位点序列的引物对原始pCB-CMVF209质粒进行扩增，并以所述多克隆酶切位点序列对应的内切酶对扩增产物进行酶切，制备得到含有所述多克隆酶切位点序列的PCR产物的酶切产物；

步骤三、酶切原始pCB-CMVF209质粒，获得大片段产物；

步骤四、取连接酶将所述步骤一中制备的酶切产物、所述步骤二中制备的酶切产物、以及所述步骤三中制备大片段产物连接，制备得到如权利要求1或2所述的低毒力黄瓜花叶病毒载体。

4.如权利要求3所述的低毒力黄瓜花叶病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤一包括：

取原始pCB-CMVF209质粒，以NcoIF引物和2aORF1R引物扩增，其中，所述NcoIF引物含有Nco I酶切位点序列，所述2aORF1R引物含有Stu I酶切位点序列和氨基酸编码序列9-17aa；

将制备的扩增产物通过Nco I、Stu I酶进行酶切，纯化，制备得到2b基因序列缺失且具有氨基酸编码序列9-17aa的PCR产物的酶切产物。

5.如权利要求4所述的低毒力黄瓜花叶病毒载体的构建方法，其特征在于，所述NcoIF引物如SEQ ID NO.2所示，所述2aORF1R引物如SEQ ID NO.3所示或SEQ ID NO.4所示或SEQID NO.5所示。

6.如权利要求3所述的低毒力黄瓜花叶病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤二包括：

将含有Mlu I、Spe I、Apa I、Sma I、Ava I、BamH I和Sac II中至少一个以及StuI多克隆酶切位点序列的正向引物和含有AvrII酶切位点序列的反向引物对原始pCB-CMVF209质粒进行扩增；

以Stu I酶和Avr II酶对扩增产物进行酶切，制备得到含有所述多克隆酶切位点序列的PCR产物的酶切产物。

7.如权利要求6所述的低毒力黄瓜花叶病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤二中正向引物含有Stu I、Mlu I、BamH I多克隆酶切位点序列，所述步骤二中正向引物如SEQID NO.6所示，反向引物如SEQ ID NO.7所示。

8.如权利要求6所述的低毒力黄瓜花叶病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤二中正向引物含有StuI、SpeI、ApaI、BamH I多克隆酶切位点序列，所述步骤二中正向引物如SEQ ID NO.8所示，反向引物如SEQ ID NO.9所示。