[发明专利]一种γ-PGA高产菌株诱变选育方法

说明书

本发明公开了一种γ‑PGA高效诱变和快速筛选的方法。首先通过硫酸二乙酯、亚硝基胍、紫外、5‑溴尿嘧啶对出发菌株进行了复合诱变，通过透明圈法筛选初筛、24孔板复筛和传代稳定性试验后，获得了一株高产、稳定性强的菌株C2，该菌株聚谷氨酸产量达到21.3 g/L，比诱变前提高43.91%。将硫酸二乙酯、亚硝基胍、紫外、5‑溴尿嘧啶等诱变剂结合使用，显著提高了菌株的突变幅度。结合多孔板技术，实现了聚谷氨酸突变株的快速筛选。

技术领域

本发明属于生物工程的微生物育种领域，涉及使用一种选育聚-γ-谷氨酸（γ-PGA）选育突变株的方法，依据此方法可以快速获得高产γ-PGA的发酵菌株。

背景技术

随着生物基高分子材料的兴起，γ-PGA起了人们的极大兴趣。γ-PAG多由芽孢杆菌产生，是一种阴离子异形肽。它具备良好的水溶性和良好的生物相容性，具有良好的开发和应用前景。根据分子量差异，γ-PGA可分别用于化妆品、食品、卫生、医疗、农业等众多领域。

γ-PGA的获取主要有三个途径：化学合成、酶催化合成、微生物发酵法。其中，化学合成法和酶催化法因产出的γ-PGA分子的重均分子量较小、同时易造成环境污染等原因，难以大规模应用，逐渐被生物发酵法所替代。微生物发酵法生产γ-PGA是工业中最常用的方法。但γ-PGA发酵菌株的产量低，一直困扰着整个γ-PGA产业。

实现菌株高产的最佳途径是进行高产菌株的选育。γ-PGA是一个多代谢模块的合成过程，参与代谢的基因在基因组中分布(图1)。目前，对γ-PGA的诱变通常使用单一诱变剂，多轮诱变之后菌株对诱变剂的敏感性会降低，突变幅度减小，负突变率增高；诱变后的菌株需要筛选获取，目前筛选通量低，影响了γ-PGA高产菌株的获取。

不同诱变剂有着不同的突变热点，紫外线（UV）是目前最常用的物理诱变剂，能引起DNA链中嘧啶之间的共价连接，形成嘧啶二聚体，影响DNA分子结构。硫酸二乙酯（DSE）、亚硝基胍（NTG）、是常见的烷化剂，前者主要通过烷基等亲电基团，移动到电子密度较高的部位（通常对应细胞的转录区），进行亲电加成反应，改变碱基的分子结构，后者主要是造成核酸的异常断裂，引起细胞的SOS修复或同源重组修复，以此来达到基因突变的目的。5-溴尿嘧啶（5-BrU）是常见的化学诱变剂，进入细胞后更容易与鸟嘌呤进行配对，使得初始碱基由原来的A=T转变为G≡C。研究表明：相对于单一诱变，多种诱变剂组合效果较好。通过不同诱变剂之间的组合可以提高诱变效率和突变幅度，提高诱变菌株的产量。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单实用、高突变幅度、高通量的选育方法，以解决目前γ-PGA生产菌株诱变选育方法对菌株产量提升有限的问题。

为了实现上述目标，本发提供了一种高产γ-PGA菌株的诱变方法，技术方案为：对原始菌株使用DSE、NTG、UV、5-BrU四种诱变剂进行复合诱变，结合透明圈法筛选出高产γ-PGA的突变株。具体步骤如下。

(1)菌株的活化：取γ-PGA生产菌株的甘油管菌种，于LB培养基平板中，30-37 ℃下活化18-24h。

(2)菌液的制备：挑取(1)中单菌落，接入LB液体培养基，150-180 r/min，35-37℃下培养18-24h。取培养后的菌液1mL，稀释10⁴-10⁶倍后备用。

(3)菌株诱变。

1) 取一只无菌试管加入(2)中菌液、DSE(0.5%-1.0%)和NTG(0.02-0.06%)，体积比为1:2:2，30-37℃，150-180r/min震荡30min，加入Na₂S₂O₃溶液终止反，3000 r/min 离心15min，弃去上清液，加入等量生理盐水重悬，得诱变菌液A。