[发明专利]一种用于多能干细胞向造血干细胞分化的材料和方法

说明书

本发明公开了一种用于多能干细胞向造血干细胞分化的材料和方法，特别是诱导多能干细胞向CD34+CD43+CD45+造血干细胞的定向分化的培养基及方法。利用上述材料（例如添加剂Ⅰ、添加剂Ⅱ和添加剂Ⅲ，或，培养基Ⅰ、培养基Ⅱ和培养基Ⅲ）和方法，可在常氧条件下实现诱导多能干细胞的定向分化，高效获得CD34+造血干细胞。本发明的材料化学成分确定，成本低，安全性高，质量稳定；本发明的方法具有耗时短、分化效率高等优点，可为组织工程、药物研发和细胞治疗等领域提供大量细胞来源，具有较佳的应用前景和商业价值。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于多能干细胞向造血干细胞分化的材料和方法，特别是诱导多能干细胞向CD34+CD43+CD45+造血干细胞的定向分化的培养基及方法。

背景技术

近年来，造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）越来越多地被应用到临床上来治疗血液系统恶性肿瘤、实体瘤、骨髓衰竭性疾病以及一些先天性疾病等，同时在儿科的血液病、遗传病、肿瘤的治疗中也表现出一定的应用发展前景。随着包括脐血和同源供体在内的干细胞移植替代来源的发展及新调理疗法的运用，极大地提高和改善了病人的预后。来源于脐血的造血干细胞因含量丰富且扩增能力强、免疫原性低、采集方便和对供体无害等优势，在多种血液系统疾病的临床治疗中具有广阔应用前景。但是目前仅通过供体无偿献血方式所提供的脐血的供应量远远满足不了临床大量需求，因单份脐带血体积小，难以满足成年患者的治疗需要，严重制约了脐带血造血干细胞的临床应用。加之临床用血存在着HIV、HCV等病原体的污染风险，以及受移植失败、移植物抗宿主病（GVHD）和造血构建延迟等不利因素的影响，导致50%以上的患者终生残疾或无法治愈。所以，即使用造血干细胞治疗，也面临着一个比较严峻的问题：如何能有足够量的造血干细胞用于移植。

诱导多能干细胞是获得造血干细胞的重要来源之一。诱导多能干细胞（iPS）是一类通过基因转染等细胞重编程技术人工诱导获得的多能干细胞，其首先由日本科学家Yamanaka在2006年运用逆转录病毒转导的方法，将Sox2、Oct3/4、c-Myc和Klf4四个转录因子转入小鼠胚胎成纤维（Mouse Embryonic Fibrobalst）细胞中，从而诱导出的重编程为一类具有类似于胚胎干细胞（ES）多能性分化潜力的干细胞。利用人类诱导多能干细胞能够在体外定向诱导分化成多种来自各个胚层的细胞，造血干细胞便是其中一种。通过使用人类诱导多能干细胞定向分化出大量的造血干细胞为临床提供安全、有效的细胞来源，成为治疗相关血液疾病有希望的新方法之一。

人类干细胞在Xeno-free的系统下分化成CD34+造血干细胞有重大的研究和临床应用价值。Uenishi, Gene, et al. Tenascin C promotes hematoendothelialdevelopment and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells inchemically defined conditions. Stem cell reports 3.6 (2014): 1073-1084中公开了利用基础培养基IF9S结合10余种小分子在低氧条件下诱导人类干细胞分化成CD34+造血干细胞。但该分化方法过程较复杂，细节较多，人为误差太大，重复性差，诱导效率得不到保证，且分化培养需在低氧条件下进行，初期分化细胞死亡严重。

发明内容

本发明提供一种用于添加到干细胞培养基中起诱导分化作用的添加剂Ⅰ，其包含：BMP4、FGF2和VEGF，其中BMP4、FGF2和VEGF的质量比为1:0.1-10（如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）:0.1-10（如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）。

具体地，添加剂Ⅰ中，BMP4、FGF2和VEGF的质量比可以为1:0.5-1:0.5-2；在本发明的一个实施例中，该比例为1:0.625:1。