[发明专利]基于视网膜组织/类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法

说明书

本发明涉及一种基于视网膜组织/类器官‑视网膜组织制备单细胞悬液的方法。本发明选用视网膜组织或类器官‑视网膜组织，并筛选出高效两种消化酶及其使用剂量和浓度、使用比例和酶的作用时间等，确保视网膜单细胞悬液内各类细胞的高活性率（存活率≥90%以上，符合细胞建库要求）、低结团率和低死细胞率；本发明方法操作简便、耗时短，可为视网膜单细胞RNA‑Sequence测序和ATCT‑Sequence测序等提供高效的活细胞；进而对测序获得的高通量数据进行系统的生物信息学分析和挖掘，揭示视网膜发育过程中不同细胞群体的转录因子变化规律，揭示细胞命运转变过程中各类细胞转录组的变化规律。

技术领域

本发明涉及眼科试验技术领域，具体涉及一种基于视网膜组织/类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法。

背景技术

世界卫生组织三个大样本的流行病学调查显示，致盲性眼病已成为继肿瘤、 心血管疾病之后的第三位影响人们生存质量的疾病。由于遗传缺陷、衰老或代谢等因素，导致以视网膜感光细胞变性为特征的视网膜变性疾病，是造成不可逆性失明的最主要原因。视网膜变性疾病是一类严重的致盲性疾病,最主要分为视网膜色素变性 (retinitispigmentosa, RP)和年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration, AMD)。遗传性RP多发于少年和青壮年，患者在青壮年时期双眼失明，国内发病率为0.3%；AMD常见于中老年人，且随年龄增加，发病率逐年升高，成为老年致盲的主要疾病。我国每年因视网膜遗传缺陷、衰老或代谢疾病导致以视网膜 感光细胞变性为特征的视网膜变性疾病，引起失明的患者高达200万，不仅严重影响患者生存质量，而且增加社会负担，开展视网膜变性致盲性眼病研究是我国经济和社会的重大需求。目前，视网膜疾病的基础与临床研究是国际科技前沿的热点和难点。

视网膜组织含有复杂的十类细胞类型，各类细胞之间相互连接，相互依存，组织结构精细；尤其是视网膜感光细胞发育、成熟过程漫长，需要经历视网膜干细胞增殖、视网膜感光祖细胞谱系发育、视网膜感光细胞亚型形成、突触连接和感光细胞外节生长等一系列阶段。目前已发现七种转录调控因子在哺乳动物视网膜感光细胞的发育过程中发挥重要的调控作用，这些因子包括OTX2、CRX、NRL、NR2E3、PIAS3、RORβ 和TRβ2。视网膜感光祖细胞向视锥或视杆细胞分化的命运，取决于在特定时期这些转录因子的活跃或者沉默。这些转录因子网络的协同及精准控制，在视网膜感光祖细胞向视网膜感光细胞亚型视锥和视杆细胞分化中发挥重要作用。但是目前对于上述这些因子动态变化的调控机制尚未阐明。常规的基于群体的转录组分析方法无法揭示单个细胞之间基因表达的异质性，也难以对极少量稀有细胞进行分析，单细胞转录组分析技术为此供了有效的研究工具。单细胞转录组测序是作为推动干细胞生物学研究强大技术手段之一，它能呈现单个细胞转录组图谱，对测序获得的高通量数据进行系统的生物信息学分析和挖掘，从而揭示发育过程中不同细胞群体的转录因子变化规律，尤其适合揭示细胞命运转变过程中各类细胞转录组的变化规律。制备视网膜组织单细胞悬液，并使其符合细胞建库标准，对于阐述视网膜发育和视网膜疾病的发生发展至关重要。

目前，国内外视觉科学研究领域中，体外获得视网膜的常用方法是用酶消化和显微解剖分离方法。然而，现有的这两种方法均耗时较长，一般需要 15-25 分钟。而实践证明，当视网膜离开活体 15-25分钟后，视网膜神经细胞的死亡率可达 40-60%；这显然对后续进行的视网膜基础与临床研究能否成功将产生较大影响，极有可能因为视网膜离体时间过长，造成研究结果失真的严重后果。

因此，急需改进现有的视网膜取出技术，以便能快速、高效地取出视网膜，提高视网膜各类细胞的存活率，以便获得真实的研究结果，为防盲致盲的基础与临床研究提供技术支撑。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种视网膜组织/类器官-视网膜制备单细胞悬液的方法，以期能够解决现有技术耗时长、视网膜神经细胞的死亡率高的问题。本发明采用如下技术方案：

设计一种基于视网膜组织制备单细胞悬液的方法，包括如下步骤：