[发明专利]基于视网膜组织/类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法

权利要求书

1.一种基于视网膜组织制备单细胞悬液的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）冲洗眼球

首先用预冷的1X磷酸盐缓冲液冲洗离体眼球，再以含庆大霉素20IU/ml的预冷生理盐水充分冲洗眼球1～3次，然后将眼球放在已预冷的眼球固定器上，剪除其表面除四条直肌外的附属组织，最后将四条直肌固定在眼球固定器上；

（2）获取视网膜神经层和后段眼球壁

在解剖显微镜下，用视网膜取出器一端的尖刀片沿眼球赤道部切开全周眼球壁，去除眼前段，先用视网膜取出勺把晶状体和玻璃体取出，再用视网膜取出勺沿视网膜下腔取出完整的视网膜神经层，将视网膜神经层放入已预冷的离心管里，剩余的半圆形后段眼球壁则继续放置在预冷的眼球固定器上；

（3）消化视网膜组织

在装有视网膜神经层的离心管里，加入浓度均为5mg/ml组织消化酶papain和Collagenase各1.5ml；再向眼球固定器上的半圆形眼球壁内等比例加满上述两种组织消化酶，再将两部分组织均放在37℃保温箱内消化10-12分钟，每隔3min用软管吹打1次，直至显微镜下观察到单个圆形单细胞形成后立即将半圆形眼球壁内的细胞消化悬液转移至装有视网膜神经层组织的离心管里，再根据离心管内两部分视网膜细胞消化悬液合并后的体积，等体积加入含10%FBS细胞培养基，以终止消化；离心后去上清；

（4）制备视网膜单细胞悬液

在含有视网膜细胞沉淀物的离心管内加入预冷1X磷酸盐缓冲液10ml，并悬浮细胞,通过40微米滤网过滤视网膜单细胞悬液，将获得的单细胞悬液离心后，去上清，加含有10%胎牛血清的培养基3ml，混匀后即得视网膜单细胞悬液。

2.一种基于类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）收集类器官-视网膜组织

悬浮每个培养孔内类器官-视网膜的培养液，合并各培养孔的类器官-视网膜悬液，移至预冷的离心管，离心后去除上清液，用预冷的pH7.4磷酸盐缓冲液充分悬浮后离心沉淀2次；

（2）消化类器官-视网膜组织

向装有类器官-视网膜的离心管中加入使用浓度均为2.5mg/ml的组织消化酶papai和Collagenase各1.5ml；放置在37℃保温箱内消化6～8分钟，每隔2分钟用软管吹打1次，直至镜下观察到单个圆形细胞形成，立即加入含10%胎牛血清的培养基终止消化，离心分离后去上清；

（3）制备单细胞悬液

在含有类器官-视网膜细胞沉淀物的离心管内加入预冷的1X磷酸盐缓冲液(pH7.4)10ml，并悬浮细胞,通过40微米滤网过滤视网膜单细胞悬液，将获得的单细胞悬液离心后，去上清，加10%胎牛血清的培养基3ml，混匀后即得视网膜单细胞悬液。

3.根据权利要求1或2所述制备单细胞悬液的方法，其特征在于，所述视网膜取出器包括手柄，该手柄一端连接具有活动性的视网膜取出勺，另一端连接具有活动性的刀片夹，所述视网膜取出勺所在平面与手柄所在轴线呈一定倾角，所述刀片夹的前端安装有一次性刀尖片。

4.根据权利要求1或2所述制备单细胞悬液的方法，其特征在于，所述离心分离条件为：300g、1200rpm、离心5分钟。

5.根据权利要求1或2所述制备单细胞悬液的方法，其特征在于，检测所述视网膜单细胞悬液质量的方法包括如下步骤：

取1微升视网膜细胞悬液加到CountatarRRigel S2型智能一体化荧光分析仪的加样孔内进行检测，得到每1微升视网膜细胞悬液内含有细胞存活率、总细胞浓度、细胞结团率、活细胞个数和死细胞个数。