[发明专利]一种用于快速鉴定枣实蝇的特异性引物对、试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种用于快速鉴定枣实蝇的特异性序列，所述特异性序列为(AT)6A(AT)6。本发明利用11种检疫性实蝇的基因组数据，发现枣实蝇的物种特异性SSR序列位点，并通过软件设计引物，PCR扩增后只在枣实蝇检测到特异性条带。最终分子生物学实验验证了枣实蝇的物种特异性SSR序列位点及其引物可以有效地区分出枣实蝇，对枣实蝇的高效率快速鉴定提供具有理论指导意义。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种用于快速鉴定枣实蝇的特异性引物对、试剂盒和方法。

背景技术

实蝇是植食性昆虫，幼虫均为潜食性，绝大多数种类为水果、蔬菜、花卉作物的害虫，严重影响我国农业经济。传统的昆虫检疫鉴定以形态学鉴定为主，但对于个体微小、形态相近的形态鉴定困难的样品，在口岸检疫时的存在一定的局限性。一方面，对于形态近似的隐存种、复合种，形态差异非常小，需要有长期鉴定经验的专一类群的鉴定专家才可能给出准确判定；另一方面，对于检疫截获的形态特征模糊的样本，如幼体及受损样本或非成虫虫体，则难以通过形态学方法有效鉴定。另外，实蝇存在大量复合种的现象，其复合种的鉴定十分困难，目前还没有一个能够涵盖所有桔小实蝇复合种的分类检索表。

随着现代分子生物学技术及生物信息学的快速发展，越来越多基于DNA的鉴定体系被应用于物种识别鉴定中。目前在实蝇类昆虫中最常用的是线粒体基因，其特点是基因两端序列相对保守，而密码子第三位碱基可以自由变异，在不同物种之间差异较大，因此常用于区分相近物种，但隐存种和复合种的种间差异小，不能有效区分，导致检疫过程中发生漏检、误检，引起国际争端。因此，需要更为高效的分子鉴定手段对实蝇类昆虫进行快速鉴定，帮助口岸形成较为完善的实蝇类昆虫的快速检测技术体系。

发明内容

本发明旨在提供利用11种实蝇的基因组survey测序数据，鉴定实蝇特异性SSR序列位点并设计引物以区分出枣实蝇，以克服现有技术中存在的不足。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种用于快速鉴定枣实蝇的特异性序列，所述特异性序列为(AT)6A(AT)6。

在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，一种特异性引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO：1-2所示。

在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，一种用于快速鉴定枣实蝇的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的特异性序列，以及权利要求2所述的特异性引物对序列。

在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，权利要求2所述的特异性引物在鉴定枣实蝇物种中的应用。

在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，权利要求3所述的试剂盒在鉴定枣实蝇物种中的应用。

在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，一种基于快速鉴定枣实蝇的特异性序列设计引物鉴定的方法，包括以下步骤：

(1)根据物种特异性SSR序列位点，利用软件设计引物，并在测序实蝇的基因组内进行比对，筛选出枣实蝇的特异性引物；

(2)利用实蝇基因组DNA作为模板，进行PCR扩增；

(3)PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测是否存在预期大小条带。

在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，在步骤(1)中，设计引物时，扩增产物在2000bp以内。

在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，在步骤(2)中，利用11种检疫性实蝇成虫，利用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒提取DNA。

在本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，在步骤(2)中，PCR扩增的体系为20μL，其中包括2×Premix Ex Taq(Takara)10μL，DNA模板1μL，10μM浓度的上下游引物各1μL，余量为灭菌蒸馏水。