[发明专利]一种应用斜生栅藻测试微塑料生物毒性的方法

说明书

本发明公开了一种应用斜生栅藻测试微塑料生物毒性的方法。以塑料微球为研究对象，以斜生栅藻为测试生物，以96孔透明微孔板为载体，通过96孔微孔板加样分析方法，采用多功能酶标仪分别测试加样0h和96h后在681nm处斜生栅藻的吸光值，利用实验组与对照组的吸光值来计算斜生栅藻的生长抑制率，利用基于Matlab自编的Weibull函数和Logit函数拟合计算出EC₅₀值，其负对数pEC₅₀，以pEC₅₀为毒性指标判断塑料微球的毒性大小。本发明方法操作简单，方便快捷，重现性好，能够广泛适用于测试微塑料的生物毒性。

技术领域

本发明属于微塑料生物毒性检测领域，特别涉及一种应用斜生栅藻测试微塑料生物毒性的方法。

背景技术

微塑料作为一类新型环境污染物受到越来越多的关注，环境中塑料残体可以通过河流、洋流和风力等外力作用进行远距离迁移，使得地球上的偏远角落也已经收到塑料残体的污染。直径小于 5mm 的塑料碎片被称为微塑料，微塑料相对于塑料碎片，其物理和光降解作用均会减弱，导致其可以在土壤或沉积物中发生持续富集，从而在环境中存在数百年至几千年。目前微塑料生物毒性的检测方法有：藻类毒性试验、溞类毒性试验和鱼类毒性试验等。

藻类是水体中的初级生产者，也是水生食物链的基础环节，在光的作用下它们吸收无机营养盐类和二氧化碳，合成有机物，为无脊椎动物、鱼类、鸟类等生物提供氧气和食物，其种类多样性和初级生产量直接影响水生态系统的结构和功能。藻类的存在无论是对水体生产力还是水体污染的自净作用均具有十分重要的意义。藻类与周围环境形成统一的整体并且互相影响，因其个体微小(一般小于200μm)、生长周期短、对有毒物质反应灵敏、容易培养等特点，在较短的时间内可得到毒物对藻类许多世代及种群水平上的影响评价，自1980年以来就被看作是理想的实验材料。如果藻类测试在生态系统的测试中被包含进去，可以提高测试系统预测最敏感生态系统反应的能力。利用藻类生物测试化学品毒性也多为国内外选用并建立了多个藻类生物测试标准方法。藻类的数量和结构在一定程度上可以反映水质及其变化情况，故而人们用它作为水质监测和评价的重要参数。

发明内容

本发明的目的在于提供一种应用斜生栅藻测试微塑料生物毒性的方法。

具体步骤为：

（1）通过预实验配制塑料微球储备液，将储备液置于4℃冰箱待用。

（2）培养斜生栅藻使其达到对数生长期，用血球计数板在显微镜下计数，当藻密度为5×10⁵个/mL时，将其作为实验藻液。

（3）将步骤（1）配制的储备液加入96孔透明微孔板中，设置好微孔板中塑料微球浓度梯度，然后向96孔透明微孔板中加入步骤（2）得到的实验藻液，制作塑料微球和实验藻液的反应体系。为防止产生边缘效应，周边孔每孔加入300μL超纯水，实验组每孔含100μL实验藻液和100μL不同浓度的塑料微球，空白对照组每孔含100μL实验藻液和100μL超纯水，实验组和空白对照组每孔总体积为200μL；静置15min，待反应体系混合均匀后，采用多功能酶标仪测试在681nm下斜生栅藻的0h吸光值RLU；然后将96孔透明微孔板置于光照3000lux、温度22℃的光照培养箱中培养，96h后再采用多功能酶标仪测试在681nm下斜生栅藻的吸光值RLU。相同条件下，每个塑料微球浓度进行9次重复实验，并取平均值。

（4）利用实验组与空白对照组的吸光值来计算斜生栅藻的生长抑制率，以塑料微球的不同浓度为横坐标，以不同浓度对应的生长抑制率为纵坐标，利用基于Matlab自编的Weibull函数和Logit函数对不同浓度塑料微球与其生长抑制率E进行非线性拟合：

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